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芪多糖的提取及含量测定的研究 ..
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芪多糖的提取及含量测定的研究 (转载)
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方云霞
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发表于: 2009-10-27
黄芪为豆科植物,是蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根,性微温、味甘,具有补气固表、利尿托毒、排毒敛疮、利水消肿、增强免疫的功能,主要药理成分是
黄芪多糖
和黄芪甙。
黄芪多糖
在医学和兽医临床上研究应用较为广泛,可作为免疫促进剂或调节剂,同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗应激、抗氧化等作用,因此
黄芪多糖
的提取具有重要意义。
目前
黄芪多糖
的提取主要采用水提取和CaO提取两种工艺,水提取分离工艺不成熟,效率较差,提取成本较高,严重影响了
黄芪多糖
的研究开发利用。李红民等(2000)报道,用pH9~10的CaO水溶液提取
黄芪多糖
,其得率显著提高,成本下降。笔者用水提取法和CaO溶液提取法进行
黄芪多糖
的提取并测定含量,以便从中筛选出效果较好的提取方法,为生产实践提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄芪根:购自甘肃省平凉市某中药材门市部。
葡萄糖、苯酚、浓硫酸、95%乙醇、丙酮,均为分析纯。
721分光光度计(四川分析仪器厂),TN型托盘式扭力天平(上海第二天平仪器厂),容量瓶,水浴锅,干燥器,粉碎机等。
1.2 方法
1.2.1
黄芪多糖
的提取
水提取法采用蒸馏水煮沸提取;CaO溶液提取法采用pH9~10的CaO溶液煮沸提取,浓缩时调至pH6.5左右,以后两种方法步骤相同。
(1) 称取黄芪根1千克,去掉杂质和泥土,粉碎成粉末。
(2) 黄芪根粉末中加6~7倍的蒸馏水(或CaO溶液),煮沸1.5小时,用4层纱布过滤,滤渣用同样方法煮沸3次。
(3) 合并滤液,调pH至6.5左右,加热浓缩至一定量。
(4) 将浓缩液以2000转/分钟离心10分钟,上清液中加3倍量95%乙醇沉淀。
(5)倾去上清液,沉淀物中再加入95%的乙醇至浓度为80%,静置,倾出上清。
(6)滤渣用丙酮洗涤2次,过滤。将滤渣放入干燥器中,-20℃冷冻真空干燥,即得到黄芪多糖。
1.2.2
黄芪多糖
的含量测定
(1) 标准溶液的制备
取经105℃干燥至恒重的葡萄糖100毫克,置100毫升容量瓶中加水溶解,并稀释至刻度,摇匀。精密量取10毫升,置10毫升容量瓶中,加水至刻度,摇匀,配成0.1毫克/毫升的葡萄糖标准溶液。
(2) 标准曲线的绘制
准确吸取葡萄糖标准溶液0.1~0.6毫升共6份,分别置25毫升容量瓶中,加蒸馏水补充至2毫升,再加入5%苯酚溶液1.0毫升,摇匀,迅速滴加浓硫酸5.0毫升,摇匀,放置5.0毫升,置80℃水浴中加热15分钟,取出,迅速冷却至室温。另以2.0毫升蒸馏水同上平衡操作作为空白对照,在490纳米波长处测定吸光度,并求出回归方程。
(3)
黄芪多糖
含量测定
取提取并经105℃干燥至恒重的
黄芪多糖
50毫克,置于50毫升容量瓶中,加蒸馏水溶解至刻度,摇匀,准确吸取10毫升,置100毫升容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,配成0.1毫克/毫升的
黄芪多糖
溶液。
吸取上述溶液0.5毫升,置25.0毫升容量瓶中,加蒸馏水补充至2毫升,依法测定吸光度值,并代入回归方程计算,求得
黄芪多糖
的相对含量。
2 结果与分析
2.1
黄芪多糖
的物理性状
提取的APS为灰白色粉末,易溶解于水,溶液呈乳白色,无杂质。
2.2
黄芪多糖
的收率
从表1可见,水提取法APS收率为3.6%~4.0%,平均为3.8%;CaO溶液提取法APS收率为5.9%~7.75%,平均为7.05%;CaO溶液提取法比水提取法平均提高APS收率85.5%。,差异极显著(p<0.01)。
3 小结与讨论
APS属于极性大分子化合物,主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖组成。研究发现,多糖的生物活性与分子量、溶解度、粘度、一级结构和高级结构有关(顾学裘等,1988;李树珍等,1995),[4][5]因此多糖提取时应根据其有效成份的不同来设计工艺路线。APS作为
黄芪
纤维质的组成部分,APS提取收率取决于
黄芪
纤维质的溶胀作用和溶解性,纤维在水中的溶胀作用和溶解性差,因此水提取法收率低。在碱性溶液中的溶胀作用和溶解性显著增加,纤维之间的酯键易断裂而发生剥皮反应,使更多的多糖得以游离而被提取出来,从而提高多糖收率。因此APS多采用不同温度的水和弱碱溶液提取,尽量避免在酸性条件下提取(李红民等,2000)。[3]目前APS的提取主要采用水提取工艺,多糖收率极低,约为2.5%左右。倪艳等(1998)采用直接水煎煮法提取APS,多糖的收率为2.0%。[6]李红民等(2000)分别采用水提取、CaO溶液提取和Na2CO3溶液提取法制备APS粗提取物,结果CaO溶液提取收率(11.7%)是水提取收率(3.6%)的3.25倍,是Na2CO3溶液提取收率(5.7%)的2.05倍。[3] 刘富岗等(2008)用水提醇沉法和碱醇提取醇沉法提取APS,并用3种不同的天然澄清剂对提取液做纯化处理,结果表明,碱醇提取醇沉法优于直接水提醇沉法;Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂对APS提取液有较好的除杂纯化效果,而且成本低,操作简便快捷,适合工业生产。[7]本研究中CaO溶液提取法比水提取法平均提高APS收率85.5%,差异极显著,表明提取APS时适合用较弱的碱溶液,能够提高多糖收率。
APS粗提物含量高低也是评价提取工艺的重要方法,多糖含量越高,说明提取越完全。倪艳等(1998)通过对APS水煎提取工艺优化试验研究表明,APS含量随着因素变化差别较小,而收率差异明显,发现以加12倍量水,提取3次,每次1.5h为最佳工艺,其中多糖的收率为2.0%,总APS含量为37.54%。[6]李红民等(2000)测定的APS含量为水提取工艺92.2%,CaO溶液工艺89.1%,Na2CO3溶液工艺88.0%。本研究中水提法APS平均含量(66.5%)比倪艳等(1998)高,CaO溶液提取法APS平均含量(82.1%)基本与李红民等(2000)相近,采用CaO溶液提取法比水提取法平均提高APS含量15.6个百分点,差异显著。
APS含量受许多因素影响,封士兰等(1997)发现APS含量与工艺流程中的乙醇浓度、药液浓度及干燥方法有关。[8]陈芳艳等(2004)用水煎法提取APS结果表明,不同提取时间、不同提取温度和不同溶比对APS含量有影响,认为提取温度为100℃,溶比为1:6,提取时间60min,提取2次效果较好,APS最高含量达6.75μg/ml。[9]孙瑞敏等(2005)改进了传统100℃水煮醇沉法从
黄芪
中提取多糖的方法,在适当的温度(62~68℃)进行提取,避免将多种物质同时提出,使提取物的组成单一,第一次提取物的的纯度达到96%以上,且外观为白色,再经一次提纯后纯度可达到99%以上,降低了能耗,节约了资源,提高了经济效益和产品品质。刘军海等(2008)利用响应面分析法对APS的提取工艺进行优化,在分析各个因素的显著性和交互作用后,得出APS水浸提的最佳工艺条件为:料液比1:7,浸提温度89℃,浸提时间45min;浸提2次,APS的实际提取率可达4.785%。王淑萍等 (2008)采用温浸法设计四因素三水平正交试验,对APS最佳提取工艺进行了优化,结果表明:四因素对APS提取的影响顺序为提取温度>提取次数>料液比>提取时间,提取最佳工艺为:料液比1∶6,提取时间90 min,提取温度100℃时提取3;采用乙醇沉淀法设计三因素三水平正交实验对其最佳分离工艺进行研究,研究发现:三因素三水平对APS分离影响顺序为乙醇浓度>乙醇加入量>沉淀时间,分离的最佳工艺为乙醇浓度为90%,加入量5倍体积,沉淀时间4 h;选用AB-8大孔吸附树脂和聚酰胺为吸附剂,不同浓度乙醇为洗脱剂对APS最佳纯化工艺进行了探索,确定了最佳纯化工艺为:AB-8大孔吸附树脂吸附,30%乙醇洗脱.这些条件的确定为
黄芪
的大规模开发和应用奠定了基础。本研究受条件限制,未探讨影响APS含量高低的因素,但是通过比较CaO溶液提取法法和水提取法所得APS含量高低,初步认为CaO溶液法比直接水提取法获得的APS含量高。
综上所述,采用CaO溶液提取法提取APS,不仅能够提高APS收率,而且能够提高APS含量,值得推广应用。
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方云霞
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