猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测试剂盒说明书
Pseudorabies Virus gpI Antibody Test Kit (PRVgpI -Ab)
用途
畜得测PRV gpI 是用于检测猪血清中伪狂犬病病毒（PRV）gpI抗体的酶联免疫检测试剂盒。gpI(又名gE)抗体的存在表明猪曾感染PRV的野毒株和/或接种过含gpI抗原的疫苗。在美国，该试剂用于猪场管理和猪伪狂犬病的根除计划。当猪场使用gpI缺失PRV疫苗（如Boehringer Ingelheim 公司，Norden公司，Syntrovet公司和Solvay公司产品），并由批准实验室检测时，该试剂被用作州/联邦猪伪狂犬病消除计划的正式判定实验。
概述
用来保护猪免受伪狂犬病感染的传统策略，包括使用普通PRV疫苗和USDA许可的基因缺失PRV 疫苗。传统的血清学方法检测免疫后PRV的感染情况有很大的局限性，因为它们不能区分免疫猪和自然感染猪。
国际上许多疫苗生产商研制了安全有效的PRV gpI缺失疫苗，这种疫苗的使用可以使血清学方法区分免疫猪和自然感染猪。在这些疫苗中使用的病毒经过选择后消除了毒力因子的合成，但并不影响病毒的抗原性。另外，由于编码非必需蛋白质gpI的DNA序列的自然缺失，从而提供了血清学的鉴别机制。因此畜得测PRV gpI检测试剂盒能够排除gpI缺失PRV疫苗免疫抗体的干扰，从而能特异性地检测出野毒株感染的动物和含有gpI抗原的PRV疫苗免疫的动物。试剂盒中使用的抗体是gpI特异性单克隆抗体。
使用gpI缺失疫苗免疫前，应使用该试剂盒或畜得测PRV筛选和/或确认试剂盒来确定猪的免疫状态。猪经过免疫后，应至少每半年使用PRV gpI试剂常规检测一次猪PRV野毒株的感染情况。
原理
畜得测PRV gpI试验使用两倍稀释(1:2)的血清在PRV抗原包被的微孔中进行。在第一次的孵育阶段，存在于血清中的包括抗gpI抗体在内的PRV抗体，与塑料板孔上的抗原反应。洗涤后，酶标抗PRV gpI单克隆抗体加到微孔板中，并在第二次孵育中竞争结合gpI病毒抗原。如果被检血清中没有gpI抗体，酶标gpI抗体可与gpI抗原自由反应。相反，如果被检血清中存在gpI抗体，则酶标gpI单克隆抗体与抗原的反应被阻断。孵育后，没有反应的标记物被洗去，加入底物/显色剂溶液后，在酶的存在下，底物转变为一种能与显色剂反应产生蓝色的物质。使用分光光度计测量650nm的吸收值A(650)。被检样品的A(650)值除以阴性对照的平均A(650)值，计算得出样品/阴性值（S/N）。样品中gpI抗体的含量与其A(650)和S/N值成反比。如果存在抗gpI 抗体，表明以前曾感染PRV野毒株或应用过普通的弱毒疫苗或灭活疫苗。使用畜得测PRV筛选和/或确认试验检测到PRV抗体，而畜得测PRV gpI试验检测不到gpI抗体的存在，表明猪免疫过gpI缺失疫苗。
试剂
1．PRV包被板 6块 30块
2．HRPO标记抗PRV gpI抗体：含蛋白稳定剂的缓冲液，庆大霉素防腐 60ml 350ml
3．阴性对照：对PRV gpI 无反应的猪血清，叠氮钠防腐 5ml 5ml
4．PRV gpI阳性对照：抗PRV gpI抗体，叠氮钠防腐 5ml 5ml
5．样品稀释液：蛋白稳定缓冲液，叠氮钠防腐 120ml 300ml
G．10倍浓缩洗涤液：磷酸缓冲液，庆大霉素防腐 235ml 1440ml
H．TMB底物液 60ml 315ml
I．终止液 60ml 315ml
自备器材
1. 50、100μl 精确微量移液器或连续移液器。
2. 一次性移液器吸头。
3. 配制洗涤液的500ml 量筒。
4. 96 孔板酶标仪。
5. 稀释样品的玻璃或塑料管。
6. 蒸馏水或去离子水。
7. 滴加和吸去洗涤液的装置。
8. 吸液用的真空和控制装置。
使用注意事项
1. 处理所有的PRV 材料以免PRV 的传播。抗原包被微孔板虽然经过化学处理，仍可能成为PRV 的传染源。
2. 勿用口移液。
3. 使用样品和试剂盒的场所不要吸烟、喝水和吃东西。
4. TMB 底物和终止液对皮肤有刺激性。
5. 试剂盒的某些成分含有防腐剂叠氮钠。处理时需要用大量的水冲洗以免形成叠氮化铜或叠氮化铅，它们在受压时可以爆炸。注意防止该成分对酶标抗PRV gpI 抗体的污染。
6. TMB 不要暴露于强光和任何氧化剂。使用洁净的玻璃或塑料容器盛装TMB 底物液。
7. 所有的试剂应在2－7℃储存。使用前恢复到室温，使用后放回2－7℃。
8. 所有的废弃液应在丢弃前合理处理以免污染环境。
9. 注意防止试剂盒成分的污染。
10.不要使用超过有效期限的试剂，不同批次试剂盒的成分不要混用。
11.严格遵守这些条款可以获得理想的结果。操作过程中的移液、时间和洗涤必须精确。
样品的制备
用样品稀释液将被检样品稀释2 倍 (1:2)。
取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在滴加到PRV 包被板前应混匀。
洗涤液的制备
浓缩洗涤液应在使用前恢复至室温并使沉淀的盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10 倍稀释（例如：每块板用30ml 浓缩液加上270ml水）。
操作步骤
使用前所有试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。
1.取出抗原包被板，在记录表上记录样品的位置。
2.在A1，A2 和A3 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阴性对照。
3.在A4，A5 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阳性对照。
4.在其余的孔内分别加入100μl 已稀释好的被检样品。
5.室温下孵育1 小时或2－7℃孵育过夜(可以将微量反应板用封条封闭)。
6.用大约300μl 洗涤液洗涤板孔，重复3－5 次。每次洗涤时洗涤液都应吸出丢弃。在洗板和加入标记物之间应避免包被板变干。在最后一次洗涤液吸出后，将板中残留洗涤液扣拍到吸水材料上。
7.每孔加入100μl 辣根过氧化物酶标记抗PRV gpI 抗体。
8.室温下孵育20 分钟。
9.重复步骤6。
10.每孔加入100μl TMB 底物液。
11.室温下孵育15 分钟。
12.每孔加入50μl 终止液，使反应终止。
13.分光光度计调零。
14.测量并且记录被检样品和对照的A(650)。
15.计算结果。
结果
阴性对照A(650)的平均值减去阳性对照A(650)的平均值必须大于或等于0.3，试验方能有效。如果试验无效，试验操作可能有误，试验应重做，并应详细阅读说明书。首先通过计算每个样品的S/N 值，判定其gpI 抗体的有无。
具体方法参见样品结果的计算。
注意：北京爱德士元亨生物科技有限公司有进行平均值和S/N值计算并提供数据汇总的仪器和软件系统（xChek）。
结果判定
1.如果S/N值低于或等于0.60，样品应判定为PRV gpI抗体阳性。
2.如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，样品应重测。如果试验结果不变，间隔一定时间后重新采样、检测。
3.如果S/N值大于0.70，样品应判定为PRV gpI抗体阴性。
注意：确定阳性应作两次重复。
计算方法
1. 阴性对照平均值的计算（NC） NC = A1A(650)+A2A(650)+A3A(650)
3
2、阳性对照平均值的计算（PC） PC ＝ A4A(650)+A5 A(650)
2
3. 样品/阴性对照比率的计算（S/N） S/N = 样本A(650)
NC
