猪瘟实验室诊断技术
2011-05-14 10:31:21 来源:兽医网
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猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV;或Hog cholera virus, HCV )引起，主要侵袭猪及野猪，引起高发病率、高死亡率的烈性传染病。由于其危害严重、流行分布广泛，成为国内外动物分子病毒学及兽医防疫研究的热点之一。我国是世界上养猪最多的国家，猪瘟(CSF)是影响我国养猪业最严重的传染病之一，每年造成数十亿元的经济损失。虽然猪瘟兔化弱毒苗的广泛应用及其它综合防制措施的实施，控制了CSF的大规模流行，但CSF仍在我国广大养猪地区不断发生和流行。近年来，出现了所谓的非典型猪瘟和温和型猪瘟，免疫失败频频发生。非典型猪瘟和温和型猪瘟的出现，使猪瘟的诊断更为困难，不利于猪瘟的控制和消灭。本文就猪瘟的诊断技术进行综述。
1、猪体接种试验
将可疑猪病料研磨液经抗生素处理后分别接种易感仔猪(10一20kg)和猪瘟疫苗免疫猪,若前者发病,后者不发病,即可判为CSF阳性。此方法比较直接，但时间比较长。
2、免疫组化法
可快速、敏感地检测到HCV其原理是用标记的特异性抗体对组织细胞内抗原的分布进行定位,在组织原位显示抗原的一门新技术,扁桃体中猪瘟病毒抗原可早在感染后2 d利用免疫组化技术检测到。Narita等利用针对E2糖蛋白的单克隆抗体检测福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品的免疫组化方法。该方法的优点是能检测长期保存的样品,缺点是较费时,而且福尔马林固定后的组织不能再进行病毒分离。
3、琼脂扩散试验(AGPT)
是临床中病原诊断和抗体效价测定的主要方法之一，本方法操作简洁、 快速易于判定, 在临床中应用广泛。但只能粗略测定被检血清中的抗体,具有群特异性,不能鉴别毒株,敏感性低,容易受到多种因素的影响而导致试验特异性、敏感性、 精确性以及结果判断的不准确，一般不采用。
4、猪瘟兔体交互试验
该方法根据CSFV野毒不引起家兔体温反应,但能使其产生免疫力,C株兔化弱毒能使家兔产生定型热反应,但对已产生免疫力的家兔则不产生发热反应。将病猪组织经抗生素处理后接种健康家兔。7 d后再用兔化猪瘟弱毒静脉注射,每隔6 h测温一次,连续3 d,如不发生定型热反应则是猪瘟。本方法的优点是能检测出被检病料中存在的是猪瘟野毒株还是兔化弱毒株,并且较敏感,但需l0余天时间才能获得结果。
5、免疫荧光中和试验(IFCNT)
是血清中和试验方法中最常用的1种,即用定量的病毒加不同稀释倍数的被检血清。同时以SPF猪血清作阴性对照,以高免血清作阳性对照进行检测。邵振华等利用IFCNT对70日龄65份、5-6月龄34份、7月龄44份的猪瘟非免疫猪血清进行猪瘟母源抗体检测,结果70日龄阳性率为52.3%;至5-6月龄全部转为阴性,而猪瘟兔体交叉试验相比较所测的阳性率分别为47.5%、42.5%.
6、正向间接血凝试验(IHA)
是将抗原抗体发生免疫反应,但抗原抗体复合物肉眼不可见时,将已知抗原吸附于红血球表面,再与相应的抗体结合,红血球便出现凝集现象,不仅肉眼可见,而且反应的敏感性也大大提高。一般在试验中选用绵羊红血球作为吸附抗原的载体。此法具有操作简便,流程较短(1～2 h),能直观测出抗体效价的高低,已开发出试剂盒,因而该方法至今依然是检测猪瘟抗体的1种主流方法,但此法的精确度不及ELISA技术。
7、酶联免疫吸附试验（ELISA）
是目前用于猪瘟抗体检测的又一项常规技术。ELISA是目前应用最广泛的一种免疫酶测定法。它用物理方法将抗原或抗体吸附在固相载体上，随后的一系列免疫学和生化反应都在此载体上进行免疫酶测定试验，包括直接法、双夹心法和竟争法及改良法。目前在临床上检测CSFV抗原的商品化ELISA试剂盒，通常是双抗夹心法。以CSFV血清包被微量反应板，与被检样品中CSFV抗原结合，然后与CSFV特异的单克隆抗体形成夹心的上层，采用辣根过氧化酶检测，底物的吸光度与病毒抗原含量成正比。此法在猪瘟抗体检测实践中得到很多改进,变得更为简便、迅速、敏感。
ELISA其中双抗体夹心法检测抗原最常用的方法,此法的原理是用猪瘟标准阳性血清(如鼠抗猪瘟多克隆抗体)包被酶标板,加入从脾、淋巴结收集的病毒待检材料,结合反应后,加入酶标二抗(如兔抗鼠IgG酶结合物)与标准阳性血清(一抗)反应,终止反应后,加底物显色,再测OD490值。试验中设置HCV阴性和阳性对照抗原,最后计算标本孔的吸收值与1组阴性标本孔吸收值的比值(P/N值),根据相应标准,判断HCV是否呈阳性,现在国内已有多家ELISA猪瘟抗原诊断试剂盒,具体操作按说明书进行。此法在猪瘟抗原检测实践中得到很多改进,变得更为简便、迅速、敏感。抗原捕获ELISA(AC-ELISA)可敏感而快速地对猪瘟进行确诊,此法对猪瘟强毒组织样品的检测效果良好,但对疫苗弱毒的检测并不敏感,因而可用于野毒感染鉴别,具体可参见高华锋等研究。
我国谢昕等1980年用酶标记抗体直接检测病猪组织和白细胞中的病毒抗原获得成功。人工感染石门系强毒24 h后，即可从病猪外周血液的白细胞中检出病毒抗原。丘惠深等应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制出可区别猪瘟兔化弱毒株、猪瘟强毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（BVD-MDV）以及BDV的特异性猪瘟兔化弱毒单抗及猪瘟石门株单抗，制成的单抗酶联试剂，即CSF单抗酶联免疫吸附试验可将注苗免疫血清、强毒血清、混合血清和猪瘟阴性血清区别开。房德兴等建立了单克隆抗体ELISA抑制试验，用于检测细胞培养物中的猪瘟兔化弱毒。周广森等1997年用单克隆抗体ELISA对某猪场40份母猪血清和240份仔猪血清进行检测，发现母猪中有10%的隐性猪瘟感染者，仔猪中有3.7%的隐性猪瘟感染者。这些猪在遇到免疫接种、转群、气候骤变等应激时，则发生非典型猪瘟，从而揭示了隐性感染的母猪是垂直传播和水平传播猪瘟的传染源。单抗ELISA的优点是快速(1～2 h)、准确、特异性强。
PPA—ELISA(HRP—SPA—ELISA):该方法可以检测CSF强毒抗体和弱毒抗体,以此判断免疫接种是否成功及保护率高低。通过检测强毒抗体的结果及时淘汰隐性感染猪,通过检测弱毒抗体了解疫苗接种的效果,制定出免疫程序;复合捕捉封闭ELISA:此法检测血清样品灵敏、特异、可靠,在1d内可获得结果。以酶标葡萄球菌A蛋白(PPA)代替酶标二抗,免去了制备和纯化兔抗猪血清的工作,简化了试验过程,但由于葡萄球菌A蛋白(SPA)与血清中IgG的结合能力较强,因而具有很好的特异性。据顾小根报道,在检测中,用微量血纸浸出液来代替待检猪血清,也有很好的检测效果,与血清对照吻合性很好。此法减少了采血时带来的麻烦,缩短了实验时间,降低了采血给猪只带来的应激强度值得在广大基层单位推广。
Dot-ELISA(斑点酶联免疫吸附试验):也是ELISA技术的1种,该方法用猪瘟弱毒浓缩抗原包被在硝酸纤维膜(NC膜)上,抗原和被检血清抗体结合,再加上酶标二抗,最后加上酶的底物来揭示抗原和抗体的反应,这种反应在NC膜上形成一棕黄色的斑点。该方法与常规ELISA技术比较,保证了特异性、敏感性同时,还有快速经济,不需特殊仪器的特点,已有Dot-ELISA诊断试剂盒,适合于基层。
8、核酸探针杂交试验
核酸探针杂交技术是在分子标记的基础上，以病毒RNA基因组为模板制备探针，在cDNA合成之后，进行Southern Blotting(Southern印迹法)。特异的核酸探针会在不同病毒基因组cDNA上产生特异的条带。此方法具有特异性强、准确可靠的优点，但诊断费用较高，可用于不同毒株的分离和鉴定。国内研究人员研制了CSFV石门血毒P80核酸探针,可检测病毒RNA的存在和对病毒RNA进行定量检测,灵敏度达2～20 pg。Cruciere等、Dable等、Colijn等利用CSFV基因组RNA构建的cDNA，与BVDV进行序列分析和比较，合成了6个探针，按照它们在病毒基因组的位置，根据特异的杂交条带可以区别CSFV和BVDV/BDV。我国赵启祖等研制了石门血毒P80核酸探针,可对病毒RNA进行定量检测,灵敏度达220 pg。核酸探针技术有特异性强、准确可靠的优点,但需要合成核酸探针,诊断费用较高。
9、免疫金标记技术(IGSS)
免疫金标记技术(IGSS)同样可以用于猪瘟的检测。这是近年来发展起来的1种以胶体金为标记物的新的免疫学检测方法。其原理是利用胶体金的强吸附能力吸附HCV抗体而将其标记,用待检抗原样本与其结合后,在标记处大量聚集,可在载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点,表明为阳性,斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。,目前该技术有胶体免疫金试纸条、免疫金层析技术、斑点免疫金渗滤法3种形式，已开发出试剂盒,按说明操作。针对HCV自身具有分离、培养、纯化困难的特点,已开发出应用单克隆抗体酶联免疫试剂来纯化猪瘟病毒抗原,从而提高检测抗猪瘟病毒抗体特异性,同时,该方法还可分开强毒和弱毒抗体,这对无害化猪场的建立具有积极意义。另外,应用基因工程技术来体外重组表达HCV保护性抗原的基因mE2蛋白,可避免纯化病毒的麻烦。目前报道多选用杆状病毒和E.coli作表达载体,余兴龙等首次报道HCV E2基因在E.coli中实现了高水平表达。该法具有与一般免疫吸附实验(ELISA)相同的特异性和灵敏性,但操作简便快速, 试剂价廉无毒,样品可长期保存,不需特殊仪器设备,斑点色泽鲜艳,结果易于判断,在基层具有广阔的应用空间。
10、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术
检测HCV在国内外已广泛应用。RT-PCR诊断技术是从感染的组织中提取总RNA为模板,应用特异引物进行反转录,再应用聚合酶进行扩增,扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测,灵敏性可达10-4半数组织细胞感染量(TCID50),再用套式引物扩增后,灵敏性可提高l 000倍。国外报道利用RT-PCR方法检测猪瘟病毒RNA有数种程序,Goldrick等利用RT-PCR对HCV进行检测,结果显示此法具有检出率高、特异性强,极微量的病料即可用于诊断,且具有生物安全性,没有任何散毒的危险,能区分与猪瘟相关的其他病毒。此方法能对HCV和BVD-MDV感染猪进行鉴别,其最小检出量为l0-1TCID50。总之,RT-PCR法快速准确,可用于疾病的诊断和流行病学调查,已成为实验室诊断猪瘟的基本方法之一。
另外,还有经典的免疫荧光抗体试验(IFA)、鸡新城疫病毒强化试验(END)、兔体交叉免疫试验等检测HCV的方法。
分子生物学方法进行CSF的诊断的敏感性是无可比拟的,尤其是RT-nested PCR方法极为灵敏,这在D.J.Paton等的比较试验中进一步得到证实。他们在6个实验室同时进行试验,验证RT-PCR方法在CSFV的检测中的灵敏性和特异性,比较了RT-nested PCR、RT-PCR、病毒分离(Virus Isolation,VI)及ELISA方法对CSF的检测结果,结果发现检测的灵敏度依次为:RT-nested PCR、RT-PCR、VI、ELISA。但是RT-nested PCR、RT-PCR的高灵敏度导致了一些样品检测的假阳性结果。提示在用PCR方法检测时要严防污染,试验必须设立严格的阴阳性对照。
参考文献（略）
（王异民，赵建增，王泽岩，高英杰）
