蛋黄抗体制备与应用进展

  摘要：本文综述了蛋黄抗体的来源、特性，IgG和IgY的区别，提取制备方法，精制IgY和粗制IgY的区别，以及蛋黄抗体在医学和兽医临床及其它领域的应用概况。旨在为更好的利用家禽作为生物反应器，研究、生产与推广蛋黄抗体提供思路。

蛋黄抗体（Egg yolk antibodies,eyAb）是指蛋黄中存在的抗体，也称蛋黄免疫球蛋白（Egg yolk immunogbulins, eylg），Leslie and B.ClemIgy（1969）提出以IgY表示。近十几年来，国内外学者就卵黄抗体的研究和开发作了许多工作，证明了免疫鸡的蛋是提供特异性IgG抗体最方便、最廉价的来源。

Jcnscncus等（1981）报道认为，一只母鸡在一个月中生产制备的卵黄抗体相当于500ml血清抗体。Bar-Joseph（1980）实验证明每ml卵黄含有3-25mgIgG，也就是说每个蛋可提供40-500mgIgG。Losch（1986）证明了yIgG和卵黄抗体对酸和温度具有一定抵抗力。当卵黄抗体1∶20稀释与0.1mol/1HCl作用2h，IgG浓度减少40%，抗体效价从log29降到log26。当与1mol/1HCl作用30min时，IgG活性降到log21；作用60min，IgG活性才完全消失。试验还证明将卵黄置于沸水中煮10min，yIgG和卵黄抗体活性降为零，煮6min几乎对卵黄中心的yIgG和卵黄抗体没有影响。

禽鸟类 IgY 与哺乳动物 IgG在科研实验的使用上没有明显的差别，而且禽鸟类 IgY还有它的一些优点，如与哺乳动物 IgG没有交叉反应；不与风湿因子反应，可降低免疫化验中的假阳性率；也不激活哺乳动物的补体；有良好的热稳定性。在蛋黄抗体的萃提精制过程中，国际通用的蛋黄抗体低温乙醇法、盐析法或层析法等蛋白质分离工艺无法解决“既要保证抗体生化结构的完整，生物活性的良好存在，又要彻底去除垂直传播病原”的难题，但有学者采用综合了物理、化学、生物等多种灭活技术，并结合酸化法、高速离心、超过滤等现代生物技术的HOF灭活工艺，成功提取、纯化制备注射用精制蛋黄抗体，且显示出（1）安全，不具备垂直传播病原的危险、不产生应激反应、对注射部位没有刺激；（2）不损伤免疫系统，无免疫抑制；（3）使用方便，易于保存（可常温保存和低温保存）；（4）注射后3－6h，抗体即被吸收入血，开始发挥效能等粗制抗体所不具有的优点。精制鸡传染性法氏囊蛋黄抗体已经获得国家二类新兽药证书，精制鸭病毒性肝炎抗体、精制小鹅瘟蛋黄抗体正在申报新兽药证书。 中国兽药114网

IgY在医学免疫诊断与疾病治疗方面的应用十分广泛。由于IgY不激活补体、不结合类风湿因子、不与蛋白A、蛋白G、哺乳动物Fc受体和补体结合，与IgG几无交叉反应，作为免疫学实验检测工具，用于测定循环复合物、类风湿因子和补体等，减少假阳性，可用于多种特异性病毒学与细菌学等免疫学检测。有学者证实IgY预防轮状病毒引起的腹泻、龋齿与蛀牙，M6P/IGFII-R抗体与一种肿瘤干扰基因有关，IgY—RA生物导弹与中药相结合，形成抗癌药物，对消化道恶性肿瘤总有效率达７６％。傅颖媛等证实应用抗白色念珠菌特异性IgY，对提高大鼠免疫功能，特异性预防白色念珠菌感染具有明显的作用。IgY在兽医临床和水产方面也有广泛的应用，预防和治疗大肠杆菌引起仔猪黄痢、白痢、水肿病，有效率高达90%以上； 对小牛致死性伤寒沙门氏菌感染、仔猪与犊牛轮状病毒性腹泻有明显成效；使用卵黄抗体添加剂的试验组比对照组分别提高23.7%、11.4%和10.0%，说明了卵黄抗体添加剂明显促进断奶仔猪的增重和饲料转化；范玉芳等制备抗传染性法氏囊病卵黄抗体注射后12h鸡体内开始有抗体，并在体内维持5～7d，第8d全部转阴，应用该抗体早期预防对缺乏母源抗体的雏鸡可提高被动免疫水平，早期应用0.5mL／只的剂量可起到预防、紧急预防作用，治疗幼鸡总有效率为91％以上；王永山等制备了抗IBD、ND的二联抗体，进行临床对照试验，结果是治疗组的保护率71％，死亡率为29％，对照组病死率70％，治疗组和对照组的差异十分显著；张英等制备抗小鹅瘟卵黄抗体，推广预防和治疗、紧急治疗，预防保护率90.8％，治愈率95.2％。此外，抗鸡新城疫病、抗鸭病毒性肝炎病、抗番鸭细小病毒病、抗鸡减蛋综合征病、抗鸡脑脊髓炎病、抗鸡病毒性关节炎抗体病、抗鸡传染性喉气管炎病、抗鸡大肠杆菌病、抗鸡沙门氏菌病等高免蛋黄抗体已有较多报道。在改善家禽生产性能方面，有学者对商品肉鸡的试验结果表明，喂以不同浓度（25 mg／kg－250 mg／kg）的抗尿素酶抗体的鸡，在体增重与饲料转化率方面有所改善。给鸡饲喂抗抗胆囊收缩素（CCK）抗体，饲料转化率明显改善，同时还可改善因采食含生大豆粉饲料所引起的鸡采食量下降和饲料转化率降低等不利影响。毛宁等制备了抗CH-108、SG-001（嗜水气单胞菌A.hydrophila），PC-007（温和气单胞菌A.sobrio），FC-007（豚鼠气单胞菌A.Caviae）四株菌的四联高免卵黄抗体，给试验病鳖注射也有一定效果。
在提倡健康养殖和保护动物健康，保障畜禽产品安全，保障人类健康的今天，蛋黄抗体具有良好的开发和应用前景。对于蛋黄抗体以后的研究开发，主要应当着力解决抗原制备（敏感性、免疫方法）、高免蛋的生产（抗体滴度）、抗体提取与纯化（精制），以更好的服务于生产。

关键词：蛋黄抗体 制备 应用

1、蛋黄抗体（IgY）概述

1·1蛋黄抗体的概念

蛋黄抗体（Egg yolk antibodies,eyAb）是指蛋黄中存在的抗体，也称蛋黄免疫球蛋白（Egg yolk immunogbulins, eylg）。科学家在鸟类的血液循环里发现三种免疫球蛋白（IgG、IgA与IgM），母鸡在细胞分裂产蛋的过程中，会将其免疫球蛋白转移至鸡蛋，母鸡血浆中之IgA与IgM，会在输卵管中与其他的蛋白质结合而构成鸡蛋蛋白的部分。比较特别的是，在成熟期中，血清IgG会经由蛋黄薄膜转移到蛋黄中，蛋黄的IgG基于与哺乳类的IgG在分子量、等电点、细胞膜上Fc受质的键结等结构上存在着相异点而被特定称为IgY。鸡卵黄免疫球蛋白G抗体是一种7S免疫球蛋白，与哺乳动物IgG略有不同。该蛋白质分子量约为180kDa，含两个亚单位，即67～70kDa的重链和22～30kDa的轻链，存在于免疫后母鸡的卵黄中。早在60年代，科学家们就发现鸡卵黄中存在IgG抗体，其含量与鸡血清相似甚至更高，但一直未引起足够的重视。显然是由于很难将IgG抗体从丰富的卵黄脂质中分离出来，使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。直到80年代初，Polson和Jensenius相继建立了有效且相对简便的聚乙二醇（PEG）提取法和硫酸葡聚糖提取法后，有关这方面的研究才比较系统和深入。eyIg 的功能与哺乳动物IgG类似，但是，二者之间又存在许多不同，Leslie and B.ClemIgy（1969）提出以IgY表示。EyIg是母禽血清IgG主动转运到蛋黄中富积形成的，其浓度高于血清IgG浓度。(E.Orlans,1967)，理化性质上与禽血清IgG相似。

在兽医领域，人们长期以来是从高免动物（如兔、鸡、牛、猪、羊、小鼠、大鼠、豚鼠等）的血清、初乳或单壳隆抗体分离IgG。近十几年来，国内外学者就卵黄抗体的研究和开发作了许多工作，证明了免疫鸡的蛋是提供特异性IgG抗体最方便、最廉价的来源。Jcnscncus等（1981）报道认为，一只母鸡在一个月中生产制备的卵黄抗体相当于500ml血清抗体。Bar-Joseph（1980）实验证明每ml卵黄含有3-25mgIgG，也就是说每个蛋可提供40-500mgIgG。当然，免疫后卵黄抗体水平高低主要取决于抗原的种类、浓度、免疫的途径和加强免疫的时间等。母鸡通过两种途径将其全部同型抗体转移到鸡蛋：首先是循环血液中的血浆抗体转移到成熟的卵泡中，这种选择性转移到卵巢滤泡的α-球蛋白主要是IgG。第二个途径是在输卵管中进行，抗体与在这里分泌的卵蛋白一起混入到鸡蛋白，而在蛋白中发现的免疫球蛋白主要是IgM和IgA，但不含IgG。Losch（1986）证明了yIgG和卵黄抗体对酸和温度具有一定抵抗力。当卵黄抗体1∶20稀释与0.1mol/1HCl作用2h，IgG浓度减少40%，抗体效价从log29降到log26。当与1mol/1HCl作用30min时，IgG活性降到log21；作用60min，IgG活性才完全消失。试验还证明将卵黄置于沸水中煮10min，yIgG和卵黄抗体活性降为零，煮6min几乎对卵黄中心的yIgG和卵黄抗体没有影响。

蛋黄抗体制备与应用进展(2)

  1·2 IgY与IgG的比较

IgY与IgG的比较见下图1和表1.

图1：哺乳动物 IgG 与鸟类 IgY 的结构图 表1 IgG与IgY的比较.从表1可以看出，鸟类 IgY 与哺乳动物 IgG在科研实验的使用上没有明显的差别，而且鸟类 IgY还有它的一些优点，如与哺乳动物 IgG没有交叉反应；不与风湿因子反应，可降低免疫化验中的假阳性率；也不激活哺乳动物的补体等。另外，鸟类 IgY还有热稳定性好等优点。

2、IgY的提取与纯化
鸡蛋黄作为特异抗体IgY的来源有许多优点。如：母鸡易于饲养，费用不高；收集鸡蛋方便，无需抽动物血，无损伤，符合现代动物保护规则；产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。Carroll和Stollar（1983）仅用总量30～475μg的增殖细胞核抗原，成功地产生鸡抗弱免疫原性RNA多聚酶II的抗体。而Stuart等分别用人胎盘膜及肝脏膜免疫，均获得大量抗人胰岛素受体和抗人胰岛素样生长因子1（IGF-1）受体。众所周知，人肝膜仅含微乎其微的IGF-1，进一步说明了免疫所需抗原量少。此前他们曾多次用相同的抗原免疫家兔均告失败。完全福氏佐剂的使用使抗体持续时间长且产量高。Gottstein和Hemmeler（1985）的实验表明，在一个月内收集的提纯IgY产量比兔血清高18倍。Gassmann等用20～30μg增殖细胞核抗原初次免疫20天后出现特异IgY抗体,30天达高峰，并持续81天以上；卵黄中无其它Ig类，使得IgY易于提纯等。此外，某些病原微生物如轮状病毒，衣原体等可在鸡胚中增殖。用这些感染的鸡胚组织为抗原免疫鸡获取相应抗体时，可省去抗原提纯的复杂过程。台湾学者苏和平等以酸、碱、酒精、食盐及加热等五种加工条件处理市售鸡蛋，结果显示室温下以酸（pH 2.73）处理壳蛋48小時，蛋黃中IgY已丧失99%；碱（4.2% w/v氢氧化钠）处理14天或饱和食盐水处理28天，可保留蛋黃中IgY 24～33%；而以酒精（16% v/v）处理4天或加热处理成溏心蛋，則可保留47% 以上。另以不同加热条件处理免疫鸡蛋，显示在使蛋黃中心温度低于70 ℃ 下加熱，依加热时间的长短，蛋黃中IgY可保存21～81%。近十几年来，已建立了许多较为高效而经济的方法。这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、自然胶，如藻酸钠、角叉菜胶（Hatta等，1990）或乙醇沉淀等方法初步纯化工蛋白质。产量约为每ml卵黄提取IgY 5～7.5mg，纯度87%～89%。Akita等在此基础上建立了水稀释法。即以9份水稀释1份卵黄，离心去除颗粒，再用硫酸盐沉淀法浓缩，并经超滤或乙醇沉淀或盐沉淀进一步纯化、浓缩，再经凝胶过滤提纯，产量达9.8mg IgY/ml卵黄，纯度94%。此实验中以PEG代替硫酸盐沉淀，可进一步提高产量。Bade和Stegemann（1984）用预冷的丙烷和丙酮（－20℃）沉淀蛋白质并去除脂质，经DEAE柱层析进一步纯化，方法简便、省时。其IgY抗体活性与用Polson法提纯的IgY之间无明显差别。且稳定性好，经3次以上冻融，抗体活性未见改变。Hassl和Aspock用疏水交换层析和凝胶过滤二步法分离提纯IgY，虽然产量不及PEG或乙醇沉淀法，但活性相似，且纯度较高。IgY的进一步提纯可用提纯其它蛋白质的方法。常见的有凝胶过滤、DEAE纤维素阴离子交换柱层析和亲和层析等方法。必须指出，许多动物IgG均可用蛋白A亲和分离。但IgY不能与蛋白A结合。McCannel和Nakai（1990）用DEAE离子交换层析分离IgY亚群。在提高磷酸盐离子浓度的同时，始终维持一定的pH值。固相金属离子亲和层析是一种蛋白质纯化技术。最常用的金属离子有Cu2+、Ni2+，Co2-、Zn2+。研究表明Fe3+离子与磷酸化氨基酸有很强的亲和力。结合于离子柱上的蛋白质常通过降低pH值或提高盐浓度或二者合并进行洗脱。Greene和Holt用固相金属离子（Fe3+）亲和层析，通过改变pH梯度，根据4个洗脱峰将IgY分为4个亚群。Marti等（1997）将重组蛋白抗原结合于Ni-NTA柱上，用免疫亲和层析纯化特异IgY，效果良好。Kim等用特异性IgY制成抗生物素蛋白质-酰化生物素系统的亲和层析柱，用于IgG的分离和提纯。用不同的提取方法所得的IgY分子量也各异。Bizhanov比较了氯仿、萄聚糖蓝(dextran blue,DB)和PEG三种提取IgY的方法，前者IgY产量比后二种方法高2～4倍；用SDS-PAGE分析其相应产物，发现DB法提纯获得三种主要的蛋白成份：34.7KDa、41KDa和66Kda，并含少量45Kda成份：氯仿法提取主要含两种蛋白成份：45.7KDa或75.2KDa；而用PEG提取获得以66KDa为主的蛋白成份，氯仿及PEG法提取的蛋白质中也包含少量41～80KDa的IgY。

3、精制IgY制备工艺

3·1精制蛋黄抗体生产工艺流程图

3·2工艺技术

免疫抗原制备系由自然病例采集毒株，经分离、脱毒、纯化、组织细胞培养，运用灭活技术保证抗原免疫原性同时防止外源病毒、细菌、支原体污染。利用高免鸡蛋作为抗体生产原料，利用蛋鸡作为适于蛋黄抗体生产的反应器，研究蛋黄抗体在鸡体内代谢规律并据此确定对鸡的免疫程序，保证抗体来源的持续广泛性和规模生产的经济性。鸡蛋蛋黄内脂肪含量高，脂肪与蛋白质比例为2：1，脂肪主要以脂蛋白形式存在，蛋黄是良好的微生物培养基，蛋黄内含有霉形体、沙门氏菌、腺病毒及呼肠孤病毒等可以垂直传播给雏鸡的病原。由此，在蛋黄抗体的萃提精制过程中，既要保证抗体生化结构的完整，生物活性的良好存在，又要彻底去除垂直传播病原，采用目前国际通用的低温乙醇法、盐析法或层析法等蛋白质分离工艺无法解决上述难题。因此，目前欧美发达国家仅将蛋黄抗体用作口服制剂，国内也仅有实验室粗制蛋黄抗体产品。有学者采用综合了物理、化学、生物等多种灭活技术，并结合酸化法、高速离心、超过滤等现代生物技术的HOF灭活工艺，已经成功地解决了上述难题。精制鸡传染性法氏囊病蛋黄抗体的安全性、有效性已获得二类新生物制品证书。小鹅瘟精制蛋黄抗体、鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体已由四川绵阳宝莱生物药业有限公司联合有关科研单位完成基础研究，并着手向农业部申报新兽药证书。精制蛋黄抗体在生产制造过程中，应充分考虑蛋黄中脂蛋白、高磷蛋白、球蛋白之间的相互作用，选择最佳离子强度、pH环境，并加入适量稳定剂，使产品能在室温下较长时间储存，其生物活性及物理外观没有任何变化，便于贮存、运输，极大的方便临床使用。

4、精制蛋黄抗体和粗制蛋黄抗体的区别

初始使用的蛋黄抗体为粗制抗体．即将高免后达到一定抗体滴度的蛋，消毒后分离蛋黄、蛋清，将蛋黄用含一定量的福尔马林生理盐水稀释，搅匀，过滤后，再加入适当抗生素即成．粗制蛋黄抗体缺点：（1）蛋黄内含有一些可以垂直传播给雏鸡的病原，如霉形体、沙门氏菌、腺病毒及呼肠孤病毒等．其生产中未进行严格消毒和灭活；（2）蛋壳表面污染的常在菌，用粗制方法无法灭活；（3）高浓度蛋黄液为污染菌引致的腐败提供最有利的条件；（4）不能也不敢贮存；（5）使用极不方便，因其粘度大，易堵塞注射器；（6）使用中经常出现应激反应；（7）稍有不慎即致人为传毒。国外鉴于此，将其喷成干粉，作为饲料添加剂供口服。

精制抗体必须解决两个问题：（1）彻底灭活技术；（2）解决大规模生产的萃提技术和工艺流程及其相配套的一系列检验、检测等。目前有学者研究精制抗体的生产工艺已取得了如下进展：（1）H.O.F灭活技术获得成功；（2）萃提采取酸化法，结合离心、超滤、除菌等，获得了可供注射用的精制蛋黄抗体．精制蛋黄抗体必须经过无菌检验、安全检验、效力检验才能进入市场。研究显示，精制蛋黄抗体特点：（1）安全，不具备垂直传播病原的危险、不产生应激反应、对注射部位没有刺激；（2）不损伤法氏囊，无免疫抑制；（3）使用方便，易于保存（可常温保存和低温保存）；（4）注射后3－6h，抗体即被吸收入血，开始发挥效能，中和相应的病毒、细菌或毒素，中止病原对机体的危害，缓解症候，恢复健康；（5）注射一次有效持续期为5－7天。精制蛋黄抗体有效期为：（1）冰箱保存（4－8℃），有效期至少2年以上；（2）室温保存，有效期为11个月；（3）避光保存为宜。

5、IgY在医学方面的应用

5·1 IgY在免疫诊断方面的应用

IgY的应用与其生物学特性密切相关。在免疫诊断方面，由于IgY不激活补体、不结合类风湿因子、不与蛋白A、蛋白G、哺乳动物Fc受体和补体结合，与IgG几无交叉反应，故可作为免疫学实验检测工具，用于测定循环复合物、类风湿因子和补体等，减少假阳性。Van Regenmortel等将鸡补体C1和豚鼠补体C1混合，进行定量微量补体结合试验，解决了禽类补体难以固定的问题。该方法适用于检测微量病毒抗原，测定病毒蛋白肽片段上的抗原活性或禽类血清抗体，可用于各种特异性病毒学检测。Terzdo等以双毛细管透析浓缩法提取特异性抗沙门氏菌肠出血型肠炎株IgY，用玻片菌体凝聚及试管鞭毛凝聚法测试了367株肠道菌和2株弧菌。结果该IgY只与沙门氏菌肠出血型肠炎株及其它抗原基因型相关的菌株起反应，表明可用此IgY检测沙门氏菌肠出血型肠炎株。αl-低氧诱导因子（HIF-1，一种蛋白质）结合于一种含有HIF-1DNA结合位点的寡核苷酸。

5·2 IgY在基因核测方面的应用

Camenisch等用HIF-1免疫并经亲和层析纯化提取特异性IgY，根据电泳迁移率分析，用Western Blot法测定人及哺乳动物细胞核提取液中的HIF-1，并用IgY抗体沉淀低氧细胞抽提液中的HIF-1，还在免疫荧光法中用此IgY测出定位于细胞核的HIF-1。由于如前所述卵黄作为特异抗体IgY的来源的许多优点，IgY在免疫学检测方面正在受到愈来愈广泛的应用。

5·3 IgY在免疫治疗方面的应用

5·3·1预防轮状病毒引起的腹泻（Rotaviral Diarrhea）

Robert用卵黄及其提取物成功地抑制组织细胞培养的轮状病毒生长。在感染动物实验模型中，特异IgY可防止动物发展为轮状病毒性胃肠炎，表明卵黄提取物可作为抗病毒抗体来源，防治婴幼儿轮状病毒腹泻。藉由给予口服的活性抗体（被动免疫治疗）来预防轮状病毒的传染病，可能是一种有前景的对抗轮状病毒抗体的应用，许多研究者证明给予口服抗-rotavirus的IgG或IgY，即能有效控制因轮状病毒感染而引起的腹泻。陈六英等研究制备的抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白的临床应用表明，抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白治疗组总治愈143例(88.27%)，对照组96例(60.0%)。经统计学处理，χ2=33.08,P＜0.01(见表3)。平均止泻天数治疗组为2.86±1.34( ±s)天，对照组为4.31±1.62( ±s)天。经统计学处理，U=8.77,P＜0.01.两组差异有非常显著性意义。从本研究的临床资料看，抗轮状病毒IgY治疗组在总有效率及止泻天数均明显优于常规药物治疗组，表明抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白的被动免疫保护效果显著。

5·3·2预防龋齿与蛀牙

Streptococcus mutans被认为是造成人类龋齿最主要的病原菌。该菌含有一种glucosyltransferase的酵素，此酵素会产生cohesive glucans而使病原菌黏着于牙齿表面，形成噬菌斑。形成蛀牙的原因即是噬菌斑内的Lactobacilli所产生的乳酸引起的，可以藉由供给IgY来避免S.mutans（造成人类龋齿之主要病原菌）附着于牙齿表面，来达成预防龋齿的可能性。

5·3·3在肿瘤研究方面，IgY也显示出了可喜的应用前景

甘露糖-6-磷酸酯/胰岛素样生长因子II受体（M6P/IGFII-R）与新合成的溶酶体酶的运输、IGFII的降解和TGFbaI的活性有关，是哺乳动物中一种高度保守的蛋白质，由肿瘤抑制基因编码，目前尚未有特异抗体可用于临床研究。Lemamy等由免疫的鸡卵黄中提取特异性抗M6P/IGFII-R抗体，用于免疫过氧化物酶染色，见M6P/IGFII-R存在于乳腺癌和卵巢癌细胞株（T47D，MDA-MB231，MCF7和BG1）的高尔基体中。另外还用于免疫组化法染色，分析了40份浸润性乳腺癌冷冻切片中M6P/IGFII-R水平及其与肿瘤大小、恶化程度以及雌激素及孕激素的关系，提示M6P/IGFII-R水平在肿瘤细胞中明显低于正常细胞，证实了M6P/IGFII-R与一种肿瘤干扰基因有关的假设。

石家庄市医科院与中科院生物所共同完成的IgY—RA生物导弹，是以从胃低分化粘液腺细胞中分离出的一种蛋白作为抗原，先免疫鸟类动物，使其产生新的抗体，再用分子生物学高新技术把这种新的抗体和具有强烈抑癌作用的一种中药相结合，形成抗癌药物。这种抗癌药物对癌细胞具有高选择性和强杀伤力，而对正常组织细胞没有损害。石家庄市医科院用这种生物导弹，对46例确诊患有中晚期上消化道恶性肿瘤且经其它治疗方法治疗效果不佳，又不能进行手术的患者进行了临床治疗，经1～３个疗程后，再对这些患者随防１～３个月，并进行病理检查。结果显示，在他们所收治的４６例中晚期上消化道恶性肿瘤患者中，有３例完全缓解（肿瘤消失或病理检查无癌细胞），占６.5%，有３２例部分缓解（肿瘤缩小或胃镜病理检查有好转），占69.5%，总有效率达７６％。在治疗过程中没有发现药物的毒副作用，没有出现血象改变、肝肾受损、呕吐、脱发、免疫力下降等现象。

5·3·4抗白色念珠菌感染

傅颖媛等研制出抗白色念珠菌特异性IgY，应用于烧伤鼠预防继发白色念珠菌感染，结果表明，应用IgY烧伤鼠痂下仅检出2例有极少量的白色念珠菌，且未形成痂下感染。与此对照的感染组则80%形成痂下侵入性白色念珠菌感染，此外，经细菌学检查鉴定，还有40%并发化脓性葡萄球菌感染。这一结果表明，白色念珠菌感染将进一步导致机体免疫功能下降，加重并发感染，应用抗白色念珠菌特异性IgY，对提高大鼠免疫功能，特异性预防白色念珠菌感染具有明显的作用。

蛋黄抗体制备与应用进展(3)

  6、IgY在兽医临床和其它方面的应用

6·1大肠杆菌性疾病

Farrely等用产毒性大肠杆菌免疫制备特异IgY抗体经口给药预防兔腹泻病。其中阴性对照组在用产毒性大肠杆菌攻击后，72h内全部发生严重腹泻；实验组在攻击前4天开始喂饲卵黄，攻击后未见明显不良反应。实验还表明正常卵黄有部分保护作用：4只家兔喂以正常卵黄，其中3只发展为中度腹泻，1只完全正常，不发病。该研究小组还进行了体外实验，表明：IgY干扰E.coli与提纯的小肠粘膜蛋白结合； IgY的此项干扰作用优于鸡血清IgG抗体。肖驰等制备的抗猪大肠埃希氏菌卵黄抗体在具有几十年历史的老猪场（大肠埃希氏菌血清型多达30多种）使用，给初生仔猪投服卵黄抗体后，7日龄的仔猪腹泻率由47.7％下降至9.4％和18.6％，8～12日龄仔猪腹泻率也比对照下降了9.5％和12.1％。表明鸡抗猪大肠埃希氏菌K88、K99、987P和F41卵黄抗体能有效地防治仔猪大肠埃希氏菌性腹泻。李学伍等将抗仔猪大肠杆菌病卵黄抗体制成干粉，其效价不变，试验表明胃液对抗体干粉效价影响不大，该多价卵黄抗体粉对发病仔猪的治愈率最高可达97.7％，比药物治疗的治愈率高21.2％。李国平等用猪大肠杆菌K88、K99、987P标准菌株做成混合株油佐制剂免疫蛋鸡,以平板凝集试验定性高免鸡卵黄抗体对各菌株的凝集反应。结果表明,高免鸡卵黄抗体对标准菌株均产生明显的凝集,而未免对照鸡卵黄抗体不出现凝集;经醋酸纤维薄膜电泳分析高免鸡卵黄抗体的γ球蛋白含量,也显示比未免对照鸡卵黄抗体有明显的提高.提示本研究的鸡高免卵黄中含有抗猪大肠杆菌的有效抗体。仔猪出生后口服猪大肠杆菌高免卵黄液,可明显降低仔猪黄痢的发病率;对已发病的黄、白痢仔猪,以高免卵黄液4ml肌注,连续2次,有明显的治疗作用,并且未发现副作用。张国红等选用经实验室确诊的患水肿病的仔猪250头，分别用猪水肿抗毒注射液（抗溶血性大肠杆菌IgY）、猪康宁（复方亚硒酸钠-VE）注射液、尖峰抗肿(呋塞咪)注射液、氧氟沙星注射液肌肉注射作治疗试验。另选用15头怀孕母猪在临床前第7d和第3d用药，观察对水肿病的预防效果。结果显示猪水肿抗毒注射液（抗溶血性大肠杆菌IgY）按推荐剂量通过母猪临产前第7d和第3d两次肌注给药，对仔猪水肿病的预防保护率达94﹒12%；发病仔猪一次肌注给药的有效率为96%，治愈率为92%，均优于其它药物，配合尖峰抗肿注射液和猪康宁注射液肌肉注射的有效率达98%以上。
6·2小牛致死性伤寒沙门氏菌感染

Yokoyama H等给鸡注射犊牛沙门氏菌疫苗，免疫后收集鸡蛋制备高免卵黄抗体粉，测得抗都柏林沙门氏菌的效价1∶5000，抗鼠沙门氏菌的效价1∶1000。该抗体用于试验，将提取的抗体干粉溶解在牛乳中，用奶瓶喂给犊牛，实验结果表明，给予效价为1∶1000和1：500的抗鼠沙门氏菌抗体的犊牛死亡率为33％，1∶250或小于1∶250的均为100％；给予效价为1∶2500和1∶5000的抗都柏林沙门氏菌抗体的死亡率分别为40％和0；对照组的死亡率为100％。随着卵黄抗体滴度的升高，犊牛出现腹泻和高热的时间延迟，且程度较轻，粪便中检出细菌数少，临床反应与抗体滴度呈现良好的量效关系。研究提示该卵黄抗体虽不能100％治愈该病，却可以大大降低死亡率。

6·3轮状病毒性腹泻

德国1995年6月批准的K88、K99、987P大肠杆菌及轮状病毒的多价多联蛋黄抗体喷雾干粉，按5％添加于日粮内，预防仔猪大肠杆菌病即腹泻，有明显效果．日本用羟丙基纤维素（HPMCP）制备的抗K99及轮状病毒的特异性蛋黄抗体WSF喷雾干粉在预防犊牛腹泻上有明显成效．

6·4改善断奶仔猪的生长性能

王建明等研究表明，使用卵黄抗体添加剂可以有效地提高断奶仔猪的生长性能，其中以断奶后第一周的效果最明显。断奶后第一周的平均日增重、平均耗料量和饲料报酬分别提高76.8%、14.5%和35.1%，全期（试验期14天）的平均日增重、平均耗料量和饲料报酬也有同样的趋势，使用卵黄抗体添加剂的试验组比对照组分别提高23.7%、11.4%和10.0%，说明了卵黄抗体添加剂明显促进断奶仔猪的增重和饲料转化。

6·5 防治家禽病毒病
目前，抗传染性法氏囊病、抗鸡新城疫、抗鸭病毒性肝炎、抗小鹅瘟、抗番鸭细小病毒、抗鸡减蛋综合征卵黄抗体等在养禽生产上被应用。此外还有抗鸡脑脊髓炎病、抗鸡病毒性关节炎、抗鸡传染性喉气管炎高免卵黄抗体。范玉芳等选择临床无白痢的鸡场以分离自11个发病鸡场的法氏囊病强毒制备灭活苗，皮下接种，2.5mL／只，每10d接一次，直到抗体达1∶128以上时，收集高免蛋，供制备卵黄液，并经无菌及安全检查合格备用。试验表明，注射后12h鸡体内开始有抗体，并在体内维持5～7d，第8d全部转阴。应用该抗体早期预防对缺乏母源抗体的雏鸡可提高被动免疫水平，早期应用0.5mL／只的剂量可起到预防、紧急预防作用，治疗幼鸡总有效率为91％以上。王泽霖等的研究也显示出相同的结果。王永山等选择健康的开产蛋鸡100只，分点注射IBD细胞培养苗和ND-Ⅰ系苗，间隔10d，共免疫3次，最后一次免疫1周后收集高免蛋，制备了抗IBD、ND的二联抗体，IBD-AGP为16，ND-HI为64。选择临床确诊为IBD和ND混合感染且有临床症状的鸡200只，其中100只为治疗组，注射卵黄抗体。另一组100只作对照，结果是治疗组的保护率71％，死亡率为29％，对照组病死率70％，治疗组和对照组的差异十分显著。当鸡群发生脑脊髓炎（AE）后，肌肉注射抗脑脊髓炎卵黄抗体（效价1∶16以上），同时在饮水中添加抗菌素，鸡群死亡率为6.4％，而不用任何药物治疗的鸡群死亡率为14.2％。试验显示抗AE卵黄抗体与病毒灵、抗菌素有良好的协同效应。张英等对试验鹅用小鹅瘟强毒尿囊液间隔10d两次皮下接种，首次为100倍稀释。2mL／只，第2次原波注射2mL／只。第2次免疫后10d～2个月，收集免疫鹅所产的蛋，制备卵黄抗体，推广预防和治疗、紧急治疗，预防保护率90.8％，治愈率95.2％。研究表明，应用卵黄抗体治疗DVH的疗效取决于卵黄抗体的中和效价及治疗时间，卵黄抗体的中和效价达28.5（8.5为上标）以上，治疗的最佳时间应在DHV进入鸭体后的28h内。抗体效价在28.5（8.5为上标）以下，或错过最佳治疗时机，或超过36h，则治疗效果极差。卵黄抗体治疗DVH的效果与病毒的量也有密切的关系.同样是中和效价为28.5（8.5为上标）的卵黄抗体，当接种DHV强毒的量是1万倍LD50（50为下标）时，卵黄抗体的保护率是100％，而接种量是10万LD50（50为下标）时，相同的卵黄抗体的保护率仅为30％。雏鸭出现病毒性肝炎症状后，死亡非常快，即使使用效价为210.5（10.5为上标）的卵黄抗体，其治愈率也仅为30％。张毓金等针对当前流行于粤闽等番鸭养殖区的番鸭新病—“花肝病”，研制出抗番鸭花肝病高免卵黄抗体，试验表明该抗体预防和早期治疗作用很好，当番鸭群出现死亡时，则效果不是很理想，这可能与该病的潜伏期长有关。 中国兽药114网

6·6防止大肠杆菌和沙门氏菌附着

鸡抗体和大肠杆菌混合物对大肠杆菌生长抑制作用的体外试验证明：鸡的抗大肠杆菌细胞壁膜的抗体可减弱或制止大肠杆菌培养平板上该菌的生长。在这一研究中，将已知浓度的鸡抗体加人到不同浓度的大肠杆菌培养物中，然后在室温中放置1.5h，接着将含抗体和大肠杆菌的混合物添加到琼脂平板上于35℃培养18h，结果观察到当每毫升培养物添加0.25mg抗体悬液时大肠杆菌的生长受到了抑制。 鸡体内抗体的总量因鸡对病原体的接触量和接触程度的不同而不同。抗体防止大肠杆菌附着于肠细胞的这类特性，在抗沙门氏菌方面也得到了证实。在这一研究中，将抗沙门氏菌抗体与沙门氏菌和肠细胞一起培养。抗体添加量为1mg／mL时，附着于肠细胞的沙门氏菌数量减少了；当抗体添加量为 10 mg／mL时效果最好。

6·7抗尿素酶

Pimentel和Cook（1988）、Pimentel（1991）等以被动免疫的方法证明了鸡接受抗尿素酶免疫接种后，其子代的生长率和饲料利用率都优于未接种母鸡的后代。Cook和Pimentel（1996）、Pimentel（1998）证明了口服鸡抗尿素酶抗体对鸡和猪性能的影响。若尿素酶受到了鸡抗体的抑制，那么胃肠道中氨的产生量就会减少。这样，节约下的能量就可被用于生长；另一方面，鸡体在较少能量饲料的情况下可保持生长率。 对商品肉鸡的试验结果表明，喂以不同浓度（25 mg／kg－250 mg／kg）的抗尿素酶抗体的鸡，在体增重与饲料转化率方面有所改善。

6·8抗胆囊收缩素（CCK）

CCK可迅速抑制禽类和哺乳动物的食欲，降低动物的采食量。可降低禽类嗉囊的收缩，控制食物进入小肠的速度；同时CCK能提高小肠的蠕动速度，减少营养物质的消化与吸收时间。给鸡饲喂抗CCK抗体，饲料转化率明显改善，同时还可改善因采食含生大豆粉饲料所引起的鸡采食量下降和饲料转化率降低等不利影响。 中国兽药114网

通常蛋黄抗体的水平反映血清抗体的水平，但其升降情况通常较血清抗体的升降延迟6d左右，ND、IBD等免疫母鸡的卵黄抗体滴度与相应的血清抗体相同或稍高，差异不显著。但以免疫鸡蛋制备的抗禽霍乱卵黄抗体的效价比血清抗体出现的迟，而且水平为低。因此凌育焱等建议不宜用产蛋母鸡制备抗禽霍乱卵黄抗体以防治该病，因为可能会出现抗体效价不高，防治效果不理想的后果。

6·9 卵黄抗体在水产及其它方面的应用
毛宁等自病鳖体内分离到CH-108、SG-001（嗜水气单胞菌A.hydrophila），PC-007（温和气单胞菌A.sobrio），FC-007（豚鼠气单胞菌A.Caviae）四株菌，并制备了四联菌苗，分3次给母鸡皮下注射，每次间隔10d，测得血清抗体效价达一定水平时，收集鸡蛋制备高免卵黄抗体，给试验病鳖注射，注射抗体后2d和3d仍有死亡。7d后仍存活的病鳖病情好转，治愈率36.6％，治疗效果有待提高，但其价格便宜，取材方便，可刺激机体的非特异性反应。给产蛋母鸡注射水稻白叶枯ZJ－173菌苗，收集高免蛋，制备针对水稻白叶枯菌的卵黄抗体，用于监测该病的发生，效果也很好。

在提倡健康养殖和保护动物健康，保障畜禽产品安全，保障人类健康的今天，蛋黄抗体具有良好的开发和应用前景。对于蛋黄抗体以后的研究开发，主要应当着力解决抗原制备（敏感性、免疫方法）、高免蛋的生产（抗体滴度）、抗体提取与纯化（精制），以更好的服务于生产。

禽类的病毒性疾病如法氏囊病或新城疫病的唯一有效制剂。

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