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猪源抗菌肽的研究进展- 温涛 何斌, 王泽岩 高英杰

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温涛 何斌, 王泽岩 高英杰
(吉林大学畜牧兽医学院, 长春 130062)

    随着抗生素的广泛应用和耐药性菌株的不断出现,细菌性疾病的预防和治疗再次成为一大难题。目前,临床上应用的大部分抗菌药物的毒副作用很大、容易产生耐药性,且价格很高。因此,寻求和研制高效、安全、抗菌谱广、不易产生耐药性、普遍实用的新型抗菌药物成为当今一项新的课题。近年来,具备新型抗菌药物潜在优点的抗菌肽不断被发现,引起研究者的重视,其中猪源抗菌肽倍受关注。本文主要就猪源抗菌肽做一综述。
    1 猪源抗菌肽的分类
目前猪源抗菌肽已发现10多种,都具有分子量小、带有正电荷、热稳定性好等特点,同时对多种微生物有杀灭作用。根据其分子结构特征,主要分为两大类:防御素家族(defensins)和Cathelicidins家族。
    1.1 防御素家族
    哺乳动物的防御素是由骨髓细胞或上皮细胞以前体形式合成,前体包含信号肽、保守的PRO结构序列和一个具有生物学活性的抗菌肽构成。分子量为3~5KD,多聚阳离子型,成熟肽含有6~8个保守的半胱氨酸残基,形成了3~4个分子内的二硫键桥。根据半胱氨酸的位置和二硫键的连接,哺乳动物的防御素进一步可分为3个群,即α、β、θ防御素。
    防御素家族的抗菌肽具有广泛的抗细菌、真菌的活性。同时也是单核细胞、T淋巴细胞的趋化肽,并且可抑制ACTH与受体的结合,抑制补体激活的经典途径,诱导组胺从肥大细胞中释放,增强脂蛋白和血管基质的结合等作用[1]。
    猪的上皮β防御素pBD-1(porcine β-defensin 1)是目前在猪体内唯一发现的防御素[2],基因全长约1.9kb,含有两个外显子和一个内含子,其mRNA在舌上皮中大量表达,在呼吸道和消化道较少。重组的pBD-1具有很强的抗菌活性,可抵抗革兰氏阳性/阴性菌以及真菌,但是,对微生物的杀灭是pH、盐和血清依赖性的,当pH小于5.5、高盐(100~150mmol/L NaCl)或有血清时都可以使之失活[3]。
    1.2 Cathelicidins家族
    Cathelicidins家族抗菌肽具有共同的结构特征,即N末端都含有一个cathelin区域[4],其基因结构呈严紧型排列,有4个外显子和3个内含子[5](如图1)。猪的Cathelicidin家族抗菌肽主要包括PR-39、Protegrinsl~5、PMAP-23,-36,-37。它们都来源于骨髓细胞,以前肽的形式储存在周边PMNs颗粒中。
    PR-39是1991年Agerberth等人从猪肠道分离出来的一种Cathelicidins家族抗菌肽,该抗菌肽是富含脯氨酸和精氨酸的蛋白质多肽,具有广谱的抗菌性,对革兰氏阴性菌的抗菌活性最强[6~9]。
    Protegrins是Cathelicidins家族中一群具有杀灭微生物活性,抵抗各种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及病毒的广谱抗菌肽,其抗微生物活性不受细胞外阳离子或血清成分的抑制。Protegrins一般由16~18个氨基酸残基组成,四个半胱氨酸形成两个分子内二硫键,以维持反平行的β-折叠结构的稳定性[10~11]。
    PMAP-23,-36,-37 属于猪骨髓源性抗菌肽,其中PMAP-36,37具有两亲性α-螺旋,而PMAP-23呈发卡样结构。该类抗菌肽具有很强的抗菌活性:PMAP-37是最强的膜活性因子,在0.2~1μmol/L时可引起细菌细胞内膜的渗透作用,而PMAP-23,36的杀菌活性分别为1~10 mol/L和10~50μmol/L[12~13]。
    2 猪源抗菌肽的作用机制
    抗菌肽的作用机制与传统抗生素有很大的不同:首先,在杀菌机制上,传统抗生素大多数是通过抑制细菌细胞壁或DNA的合成而发挥作用,而抗菌肽主要通过对带负电的微生物细胞膜直接作用,改变其通透性,造成膜的物理性损伤,导致细胞内容物外渗而死亡;其次,在作用方式上,传统抗生素作用涉及到细菌细胞膜上或胞内特异的受体结合,且受体类型有限,细菌容易通过变异而产生耐药性,抗菌肽的作用不涉及特定的受体,完全是阴阳离子的物理作用,它可以很快杀灭微生物而不产生耐药性。
    大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏细胞或细菌质膜结构,引起胞内水溶性物质大量渗出,从而最终导致细胞和细菌的死亡。其杀菌作用的具体过程可分为3步,即:(1)肮菌肽分子通过静电作用结合于细胞膜带负电荷的磷脂双层,使磷脂双层局部变薄;(2)在细胞膜电势的作用下,抗菌肽分子的疏水部分插入细胞膜,其两性分子的α-螺旋插入膜内,然后多个抗菌肽分子共同形成离子通道,使膜通透化;(3)改变细胞膜的通透性及细胞能量状态,导致细胞膜去极化,呼吸作用受到抑制以及细胞ATP含量严重下降,最终导致靶细胞死亡、
3 抗菌肽的基因工程研究进展     在抗菌肽的基因工程技术中,通过抗菌肽基因的克隆与表达而大量生产抗菌肽是一种较为直接而有效的方法。研究表明,猪源抗菌肽基因表达方式有两种,即组成性表达和诱导性表达。     3.1 抗菌肽的表达体系     抗菌肽的表达体系主要有酵母菌、大肠杆菌、昆虫细胞/杆状病毒群蛋白表达系统和哺乳动物细胞表达体系。(1)酵母表达体系的表达产物可糖基化且属于分泌性表达,能适应工业化生产,但存在表达产物对宿主的杀灭作用。(2)大肠杆菌表达体系已经成功的表达了多种抗菌肽,但是存在产率不高和产物活性低等缺点。(3)Valore等(1998)成功地在昆虫细脚杆状病毒群蛋白表达体系克隆和表达HBD-1基因,但其最大缺点是外源蛋白处在极晚期病毒启动与调控下,而此时细胞已经开始死亡。(4)哺乳动物细胞表达体系表达真核蛋白时,主要表现在蛋白合成起始信号、加工、分泌、糖基化方面,但目前哺乳动物表达产量不高,成本较大。     3.2基因工程方法     在基因工程领域所运用的方法主要有以下两种:    一是利用差异显示技术(differential display DD),对进行诱导和未进行诱导的生物的基因的差异表达进行研究,可得到一些新的抗菌肽类相关基因,这是关于基因分离、表达研究的较新方法。Kin等就利用差异显示技术分离到了一种新抗菌肽Enbocin他们用大肠杆菌感染家蚕(Bombyxmor}幼虫,构建cDNA文库,后以α-32pATP标记,选出感染的与未感染的Bombyxmori差异DNA克隆,在基因文库中用人DASH试剂筛选出阳性克隆,酶切、测序,得到Enbocin基因序列。据此设计引物从昆虫细胞mRNA进行RT-PCR扩增,在将此扩增片断导入克隆载体与表达载体,最后用Northern blot尿素-SDS-PAGE可证实并检测到Enbocin的表达。在国内,刘振义、屈贤铭也利用该方法成功得到了长度为241bp的片断,该片断可能在昆虫免疫反应中扮演重要角色。     二是采用融合表达的方法,该方法是将抗菌肽基因与另外一种基因连接起来,共同构建成融合基因,并克隆到表达载体上,最后在经诱导、切割而得到抗菌肽基因表达的蛋白。之所以采用这种方法,其原因是抗菌肽所携带的碱性氨基酸对蛋白酶非常敏感,而采用融合表达的方法以抵消其碱性并降低其对宿主细胞的毒性。庞实锋等通过PCR技术和体外DNA重组技术将CecmpinAD连接在haFGF改构体的5’端,构建成融合基因CADAF将其克隆到表达载体pET3c上,然后转化到BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。经DNA序列分析,合成的CADAF基因序列与设计序列一致。构建的CADAF基因在BL21(DE3)中获得了表达。虽然现在抗菌肽的基因工程取得了很大的成就,但问题的存在也是不容忽视。比如如何进一步提高表达水平,提高基因表达产物的稳定性,设计并合成杀菌活力更强、杀菌谱更广的抗菌肽等,都是需要解决并值得深入研究的课题。    近年来,在昆虫和植物抗菌肽基因工程方面,国内外已有不少成功的报道,如抗菌肽天蚕素A、B已在昆虫系统中得到表达,柞蚕抗菌肽D、绿蝇抗菌肽在酵母系统中得到表达,天蚕抗菌肽A在真核系统中表达,但就畜禽抗菌肽基因工程国内外报道很少。因此,运用基因工程技术,通过对畜禽抗菌肽的研究,对提高畜禽的抗病能力、减少甚至替代抗生素的使用将起积极的促进作用。目前,在猪的抗菌肽方面国内已有了一些研究,如罗刚等已建立了猪PMAP-37的基因和防御素PD表达载体;汪以真等对猪PR-39基因进行了克隆和序列分析。但在畜禽抗菌肽的基因表达尚未见报道。     4 展望     由于长期以来抗生素的大量应用,许多细菌产生了耐药菌株,而新型抗生素的研发速度又不够快,因此矛盾日益突出。抗菌肽独特的抗菌机理为这一问题的解决提供了可能。另外,抗生素在畜产品中的残留问题也越来越引起人们的重视,它直接危害到了人类的健康,通过基因工程的方法生产出的抗菌肽添加剂为解决该问题提供了有效的途径。     抗菌肽作为新型的抗菌药物不但能够很快的杀灭微生物,同时也不易产生耐药性,因此使得其在细菌性疾病的治疗、畜禽饲料添加剂、生物制药等方面都显示出诱人的前景。相信随着抗菌肽研究的不断深入,在不久的将来,抗菌肽将在解决上述问题上发挥重要作用
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