染色试验是弓形虫病所特有的免疫血清反应诊断方法。其原理是弓形虫在与阴性血清作用后仍能被碱性美蓝染液所深染，但与阳性血清（抗体）作用后则不着色或着色很淡。这种抗体称为胞浆改变抗体，其在辅助因子参与下，可使弓形虫胞浆中本来可以被着色的成份消失。据此便可判断被检者血清中是否含有弓形虫抗体。该法的优点是待异性强，感染后数天即可出现这种抗体，可用于早期诊断。但本法所用抗原为活虫，欠安全；及辅助因子的获得较困难，是其不足。以下为弓形虫染色试验的方法。
（一）材料准备
1．抗原制备 采取人工感染弓形虫72h后的小白鼠腹水，加生理盐水反复离心洗涤2～3次（3000r／min，10min／次）后，用生理盐水混悬稀释至 400～600倍镜检时，每个视野含虫体30～40个，即每毫升混悬液含弓形虫约500万个。
．辅助因子 即健康人血清。并非每个健康人的血清都含有这种辅助因子，须预先经过测试，大约6个人中有一个人合用。测试方法是取上述抗原0.12ml，加待测血清 0.O8ml，混合后于37℃水浴中作用1h，冷却，加入碱性美蓝液O.1ml，混匀，静置10min，吸出镜检100个游离虫体，若90个以上虫体着色时则该血清可用。
3．碱性美蓝溶液 以 95％酒精中的美蓝饱和溶液（约为 1.48%）l份，加 pH1l的缓冲液9份混合即成。pH1l的缓冲液为0.53％碳酸钠（Na2CO3）溶液 97.3ml，加 1.91％硼砂(Na2B407•10H20）溶液2.7ml。
4．被检血清 采血分离的待检动物血清。用前置56℃水浴中30min灭能。
（二）实验操作兽医教学参考,兽医临床交流.f+z#O7K%n1i8{
将被检血清用生理盐水作倍比稀释至1:256，然后各取0.1ml分别置试管内，各加辅助因子（健康人血清）0.2ml，再加抗原0.lml。置37℃温箱中12h，取出待冷；加美蓝染液2～4滴，振荡5～6min后，分别镜检计数各管内100个游离虫体的着色与未着色的比例判定结果。另设阳性对照和阴性对照管，前者以阳性血清代替被检血清并同样稀释，后者以生理盐水代替被检血清。
（三）判定标准
在阳性对照虫体全部不着色、阴性对照90％以上虫体着色的情况下，对被检血清管进行判定。以未着色虫体在60％以上为阳性，40％～59％为可疑；39％以下为阴性。对猪弓形虫病，当1:16～32呈阳性时为可疑，1:64为阳性时判该猪为已受感染。
3p) 附: 寄生虫标本的采集、制作和保存。
．吸虫的采集、固定与制片
（1）采集 吸虫宜用弯头针、弯头镊、毛笔挑取，小型的或以吸管吸取，不可以镊子夹取，以免损伤虫体，影响观察。体表附着的污物应该放在生理盐水中以毛笔轻轻刷去，或密闭容器开口充分振荡，除去污物。吸虫的肠内容物过多时，可在生理盐水内放置过夜，待其食物消化或排出。这种洗净而尚未固定的虫体是半透明的，应先镜检观察。兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台
（2）固定 在制作染色封片标本之前，须先把虫体压薄，固定。常用的固定方法有如下几种。
兽医教学参考,兽医临床交流 ①饱和升汞醋酸溶液固定法 将放在生理盐水中伸张好的吸虫，放入加温至60～70℃的饱和升汞醋酸溶液（饱和升汞98ml，加冰醋酸2ml）中，固定后将虫体移入 50％酒精中，洗去升汞液。然后再移入75％酒精碘溶液中。2～3h后，再换到70％酒精中长期保存。
②劳氏摇动法固定 适用于小型吸虫。将小型吸虫放入盛满生理盐水的试管中，摇动3min，使虫体下沉，倒去一半盐水，加入等量饱和升汞醋酸液，再摇1min，移入纯饱和升汞液中15～30min，再移入75％含碘酒精液中，至不褪色，然后放入70％酒精液中长期保存。
③福尔马林固定法 将洗净、伸张好的吸虫放于两玻璃片之间，稍加压力压平，玻片两端用胶皮圈缚住，不可过紧，以免压坏虫体。放入 10％福尔马林液中3～7天，然后移入30％ 福尔马林液中长期保存。小型虫体可不通过10％福尔马林液．直接放入30％的福尔马林液中。
（3）制片 吸虫标本的形态观察，常需制成整体染色装片标本或切片标本。整体装片标本的制法如以下两种。
①德氏苏木素染色法 取保存于70％酒精内的虫体逐步通过50％、30％酒清液各0.5h。置蒸馏水内0.5h。放入德氏苏木素染液内2～24h。用蒸馏水换洗后依次移入30％、50％、7O％酒精中各0.5h。用含2％盐酸、70％酒精液褪色至全部构造清晰。用70％酒精换洗两次，如加碱性溶液于酒精中，标本呈蓝色。依次移入89％、90％、100％酒精中各0.5h。再移入冬青油与纯酒精各半的混合液内0.5h。然后移人冬青油或木馏油中透明。透明后用阿拉伯树胶封片。
②硼砂洋红染色法 将保存于福尔马林中的虫体先用蒸馏水冲洗数次，依次移入30％、50％、70％酒精中各0.5～1h。将虫体移入硼砂洋红染液中30min至数小时（视虫体大小而定）。移入含2％盐酸的70％酒精液中褪色适宜为止。再依次移入8O％、90％、100％酒精中脱水1～2h。置于纯酒精与冬青油各半混合液中0.5～1h。然后移入冬青油中透明、封片。
德氏苏木素染液配制：苏木素1g溶于l0ml纯酒精中，然后加入l00ml饱和氨明矾液，放于日光下14～28天，再加入25ml甘油、25ml甲醇，置3～4天后过滤即成。使用时用蒸馏水冲淡 10～15倍。
硼砂洋红染液配制：4％硼砂水溶液 100ml，加入洋红1g。煮沸熔化，再加 70％酒精 100ml，24h后过滤即成。
2．绦虫的采集、固定与制片
（1）采集 绦虫的挑取和洗净方法同吸虫，但由于头节易断离，动作宜轻。如果绦虫头节附着在肠壁上很牢，应将附有绦虫的肠段连同虫体一起剪下，浸入生理盐水中数小时，头节会自行脱离肠壁。
（2）固定 绦虫肌肉发达，伸缩力强。节片还要压薄后固定。大型绦虫一般只切取头节、若干成熟节片和孕节制成封片标本。若准备作瓶装陈列标本，则应预先将虫体绕在一玻璃瓶上，再连瓶浸入盛有固定液的更大的瓶内固定之。在固定前应放于两玻片间夹平，压紧投入秦氏液或波氏液，也可用70％热酒精或10％～50％福尔马林液固定。幼虫固定前用手将头节挤出或在活体时用消化液孵出，洗净，压平后固定24h，然后依次移入30％、50％、70％酒精中，最后放于新的70％酒精中保存。
（3）制片 固定、保存好的标本可用德氏苏木素染液或明矾洋红染液中染色。染色、脱水、透明、封片等方法与吸虫相同。
洋红染液配制：洋红4g，盐酸2ml，水15ml，85％酒精95ml。先将洋红溶解在盐酸与水中，煮沸后加 85％酒精 95ml，加热片刻，滴入按液数滴中和盐酸，过滤即成。
明矾洋红染液配制：2.5％氨明矾水溶液100ml，加洋红1g，煮沸20min，冷却后过滤即成。
3.线虫的采集、固定与制片
（1）采集 线虫成虫多寄生于消化道、呼吸道、体腔及循环系统，幼虫多见于肌肉或各器官系统组织中。采集时用小镊子或解剖针挑取，肺部的线虫和丝虫目的线虫易破裂，应略加洗净后立即放入固定液中固定。
（2）固定 线虫的固定可用70％酒精或3％～5％福尔马林生理盐水，或10ml福尔马林、10ml冰醋酸和80ml生理盐水配成的福尔马林冰醋酸固定液。
大型线虫用生理盐水洗净后保存于5％福尔马林内。小型线虫取出后计数，用生理盐水洗净，保存于巴氏液或甘油酒精内，微小虫体计数后放于巴氏液中固定。
对腹腔丝虫及肺丝虫最好直接放在热的5％福尔马林中固定，以免破碎。
固定时应先将固定液加热至70～80℃（皿底出现小气泡），然后将洗净的活虫体挑入固定液中。这样虫体伸直，便于观察。固定后的虫体最好移入甘油5～10ml与70％酒精90～95ml的酒精甘油溶液中保存。
线虫一般不做成染色封片标本，以便滚动虫体，能从不同的侧面进行观察。新鲜的虫体比较透明，很多结构清晰可见。透明的方法有如下几种。
①甘油透明法 将保存于酒精甘油溶液中的虫体，连同保存液一起倒入平皿中，置温箱或水浴中，使酒精和水逐渐蒸发，最后只留下甘油和已透明的虫体，就可进行观察了。
②乳酚液透明法 乳酚液由乳酸、石炭酸、甘油和蒸馏水按1:1:2:1的比例混合而成。由保存液中取出的虫体先移置乳酚液与水的等量混合液中0.5h，再移至乳酚液中，数min后即可透明。
③石炭酸透明法 自保存液取出的虫体放入含水10％的石炭酸中，可很快透明。若过度透明，可滴1滴纯酒精在覆有虫体的盖玻片边缘。
乳酸和石炭酸不能长期浸渍虫体，观察后应立即移入保存液中；石炭酸透明的虫体须换3次保存液，充分除去石炭酸，否则虫体会变成褐色，变烂。
如因需要将线虫作成封片标本时，不必染色，只需通过各级酒精脱水后，以水杨酸甲酯或二甲苯透明，再以加拿大树胶封固即成。
不同脏器取出的虫体应分别计数和保存，并用铅笔书写标签，写明动物种类、虫体类别、寄生部位、编号等。
巴氏液：福尔马林30g，食盐7.5g，水1000ml。
甘油酒精：70％酒精95ml，甘油5ml。
4．蠕虫虫卵标本的采集与保存
（1）虫卵采集 可用漂浮法、沉淀法或筛兜集卵法从粪中采集，也可将活虫置生理盐水中令其产卵后收集之，或将虫体破坏，取其含卵部分研碎。但后两种方法采得的虫卵往往颜色谈于粪中采得者。
（2）固定 虫卵的固定可用下列各种溶液。
福尔马林100ml、95％酒精30ml、甘油10ml、蒸馏水56ml的混合液；或10％福尔马林。若福尔马林浓度低于5％时，则应加热到约80℃固定之，加热可杀死虫卵，以免继续发育。
（3）封片标本 虫卵一般不作成封片标本，直接以新鲜的或已固定的虫卵吸置载片上，加盖片后镜检。若欲制封片标本，可用甘油明胶或洪氏液。
3t0C+o7P$m4i n9n d&~封片前，应先使已固定的虫卵通过低浓度酒精至含甘油5％的70％酒精中，揭开瓶盖，置温箱内，使酒精和水分逐渐蒸发，只留下甘油。取此材料少量置载玻片上，加上述封固剂1滴，盖上盖玻片即成。
甘油明胶：明胶20g、蒸馏水125ml、甘油100ml和石炭酸2.5g配成。
洪氏液：鸡蛋白50ml、福尔马林40ml、甘油l0ml混合均匀后，置干燥器内吸去水分，至体积为原容量的1／2为止。
5．蜱螨昆虫标本的采集、制作与保存
（l）采集
①寄生于畜禽体表或体内无翅寄生昆虫的采集 在畜体体表寄生的昆虫如血虱、虱蝇、毛虱、羽虱、蚤等，可用手或小镊子采集或将附有这些虫体的毛或羽毛剪下，再用小镊子取下，收集于皿内或小瓶内。
在畜体上采取硬蜱时，蜱可能叮得很牢，应滴上煤油、乙醚或氯仿，再轻轻用镊子夹住其假头部与家畜的皮肤呈垂直，然后向外拔，务必将假头部拉出皮肤。
寄生于牛皮下的牛皮蝇成熟幼虫，当其已移行到背部皮下时，用手摸之，可感到有隆起，隆起上可见有小孔。用双手挤压隆起部，幼虫即可自孔中迸出。
羊狂蝇幼虫寄生在羊鼻腔内，生前采集比较困难，只能在死后将鼻腔剖开，在鼻腔、鼻窦、额窦中采集幼虫。
马胃蝇幼虫寄生在马属动物的胃内，大量采集只有宰后剖开胃，进行收集。少量胃蝇幼虫常可在其成熟时随粪便排出，可在此时由粪中采集。
②在畜体吸血的有翅昆虫的采集 在畜体表面有许多有翅的昆虫。对采集小型的有翅昆虫（如蚊、库蠓、蚋等），可用大试管罩住捕取或用特制的吸蚊管吸捕。对采集体型较大的昆虫如牛虻、厩蝇等可用手捕捉或用广口瓶罩住捕取。其幼虫、蛹、卵可在相应的孳生地寻找。有些蜱可在畜舍、禽舍的墙壁缝隙中找到。牧地上的蜱则以毛皮做成旗状，在草上或灌木间拖动，使蜱附着在旗上收集之。
（2）保存 根据种类和需要，可将采得的蜘蛛昆虫制成浸渍标本、干燥标本或封片标本。
①浸渍标本保存 浸渍标本供陈列用，也可用以观察外形和体表较大的结构用。本法适用于无翅昆虫如虱、虱蝇、蚤和蜱以及各种昆虫的幼虫和蛹等。但在固定之前，应先将饱食的虫体（主要是吸血的蜘蛛昆虫）存放一段时间，待其食物消化吸收后再固定。
固定液可用 80％酒精或 5％～10％的福尔马林，保存用 80％酒情加 5％甘油，也可用苦味酸一氯仿一醋酸固定液（95％酒精120ml中溶解苦味酸12g，再加氯仿2Oml和冰醋酸10ml），活的或死的标本在该液中过夜，然后保存于 70％酒精中（含 5％甘油）。软体的昆虫可保存于10％福尔马林或福尔马林生理盐水中。也可用潘氏液，其由冰醋酸4ml，福尔马林6ml，蒸馏水30ml和 95％酒精 15ml配成。浸渍标本保存于标本瓶或标本管内，每瓶中的标本约占瓶容量的1／3，保存液则应占瓶容量的2／3，加塞密封。
②干燥标本保存 适用于有翅昆虫的成虫。采集到的有翅昆虫，应先放入毒瓶中杀死。毒瓶的制备如下：用250ml广口瓶或长10cm，直径3cm的标本管在管底放压碎的氰化钾或氰化钠约半厘米厚；再放干石膏粉盖在氰化物上压平，厚约半厘米；再浇入以水调成糊状的石膏于其上，厚约半厘米。开盖过夜。也可在管底放入约占管高1／5的碎橡皮块，注入氯仿至淹没橡皮块制成氯仿毒瓶，用软木塞塞紧过夜以吸水纸或滤纸剪成瓶底大小，紧铺于石膏或橡皮块上即成。氯仿用完后，应将圆纸片取出，再注入氯仿。使用时，将活的昆虫移入瓶内，每次每瓶放入昆虫不宜过多，昆虫入毒瓶后5～7min之后死亡。死后，将昆虫取出保存。
干燥保存又分针插保存和瓶装保存。
①针插保存 对虻、蝇等较大昆虫可用2号或3号昆虫针，自虫体背面、中胸偏右处插入，使3／4的外长度插到虫体下面。以针或小镊子将足和翅等整理成活时状态，插上硬纸片制成的标签，再插于木板上，经l～3天使标本干燥。已充分干燥的标本可放入标本盒内，盒的四角插有樟脑块。盒口上涂有含有杀虫剂的油膏，放阴凉干燥入保存。
如为蚊、蚋等小型昆虫，则以 00号昆虫针，插穿一长15 ×5mm硬纸片之一端，使针的1／2以上穿过纸片，再以此针向昆虫腹面第二对足之间插入，但勿穿透。纸片的另一端从相反方向插入一个3号昆虫针，再插于软木板上干燥。小型昆虫也可用塞璐珞或长片纸剪成高8mm，底边宽4mm的等腰三角形，三角形纸片的顶端蘸少许加拿大树胶再粘住昆虫胸部侧面，纸片的另一端朝下插入一个3号昆虫针，再插于软木板上干燥。
②瓶装保存 若大量同种标本不必逐个针插时，可将毒死的虫放一平皿内干燥后放入广口瓶内保存。广口瓶底部放一层樟脑粉，盖一层棉花，再铺一层滤纸。虫要逐个放入，每放入一定量后，放一些软纸片，以使虫体互相隔开。最后塞紧瓶口，以含杀虫药的油膏封口。在瓶内和瓶外应分别加标签。
③封片标本 适用于较小的蜘蛛昆虫，也可将虫体的局部制成封片标本。制作的过程是先将虫体放在10％氢氧化钾溶液中浸泡若干小时或煮沸若干分钟，使内部组织溶解。取出，放入加有数滴醋酸的水中约1h，再水洗几次，务求将体内外的氢氧化物洗净。然后经各级酒精脱水。一般不必染色。脱水后再透明、封固。
封片标本的另一制作方法是聚乙烯醇一乳酸酚封片法。标本不需透明、脱水。封固剂配法：先配合聚乙烯酸（简称 PVA）20％的水溶液，配时将水和 PVA一道加热、过滤。以此液56份加石炭酸和乳酸各22份即成。
另一种半永久封片标本可用氯醛胶封固。氯醛胶有许多种配方，培利氏的配法为：阿拉伯树胶 15g（研成粉状），加蒸馏水 20ml，在水浴锅中加热溶解，如溶液混浊，可用保温漏斗过滤。较透明或经氢氧化钠处理过的虫体，不必脱水透明，可直接封固。如在盖片四周用漆环封,防止不分过度蒸发,可延长保存时间。1G&]5q-C1t
6.原虫标本的采集和制作
粪中原虫卵囊和包囊，可在粪液中加入10%福尔马林长期保存。
组织中的原虫，可连同组织制成组织切片或浸泡标本（浸于5%～10%福尔马林）。
肉孢子虫可连同少量组织夹于两玻片间浸于福尔马林或70%酒精中。至于以培养或动物接种等保存原虫的方法.
