酶联免疫吸附试验(ELISA)
本试验是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种测定方法,以物理吸附法制备免疫吸附剂。现介绍猪病诊断中常用的两种方法-间接法和夹心法。
①间接法 将已知抗原吸附(或称包被)于固相载体,孵育后洗去未吸附的抗原,随后加入含有特异性抗体的被检血清,感作后洗涤未起反应的物质,加入酶标抗同种球蛋白(如被检血清是猪血清,则需用抗猪球蛋白),感作后再经洗涤,加入酶底物,底物被分解后出现颜色变化,颜色变化的速度及程度,与样品中的抗体量有关,即样品中的抗体愈多,颜色出现愈快、愈深。
材料：0.05摩/升、pH值9.6碳酸盐缓冲液,稀释液用 0.01摩/升、pH值7.2磷酸盐缓冲盐水(含0.13摩/升氯化钠,5%犊牛血清),洗涤液用0.01摩/升、pH值7.2磷酸盐缓冲盐水(含0.13摩/升氯化钠,0.05%吐温-20),30%双氧水, 邻苯二胺(OPD),pH 值5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,2摩/升硫酸,抗原,阳性血清,阴性血清,待检血清,酶标兔抗猪免疫球蛋白G,40孔聚苯乙烯酶联板,酶联免疫检测仪。
操作：
1)用碳酸盐缓冲液配制一定浓度的抗原包被液包被酶联板,每孔100微升,置37℃条件下2小时,或在4℃冰箱内过夜。
2)倾去孔内液体,用洗涤液加满各孔,洗涤3次,每次3 分钟,然后倾尽洗涤液。
3)除调零孔外,其余孔加入用稀释液稀释的待检血清,每孔100微升,同时设立阳性、阴性血清对照,置37℃下反应 1.5小时。
4) 抗体效价测定：将待检血清进行倍比稀释,每份血清加二排孔,即同一稀释度的血清加上下相邻的两个孔，每孔l00微升,调零孔不加血清。同时设立阳性、阴性血清对照。置 37℃反应1.5小时。
5)洗涤同2)。
6)除调零孔外,每孔加入酶标记兔抗猪免疫球蛋白G 100微升,置37℃下反应1.5小时。
7)洗涤同2)。
8)每孔加入新配制的底物溶液(取邻苯二胺40毫克,溶于100毫升pH值5磷酸盐-柠檬酸缓冲液,临用前加入30% 双氧水0.15毫升)100微升,室温下观察显色(5－30分钟)。
9)每孔加入50微升2摩/升硫酸终止反应。
10)用酶联免疫检测仪测定每孔490纳米波长的光密度(OD)值。
②夹心法 本法是检测抗原的方法,将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面,然后加入含有抗原的溶液,使抗原和抗体在固相表面形成复合物,洗除多余的抗原,再加入酶标记的特异性抗体,感作后冲洗,加入酶的底物,颜色的改变与被测样品中的抗原量成正比。
材料：同间接法。
操作(以检测猪瘟病毒抗原为例)：
1)抗体包被：将一定浓度的猪瘟高免血清(用碳酸盐缓冲液进行稀释)包被酶联板,每孔100微升,置37℃下2小时, 或4℃冰箱中过夜。
2)洗涤：同间接法
3)加被检样品,除调零孔外,每份样品加2个孔,每孔加 l00微升,同时设立阳性抗原、阴性抗原对照,酶结合物对照 (抗体加磷酸盐缓冲盐水加酶结合物),置37℃下反应1.5－2 小时。
4)洗涤,同2)。
5)加底物溶液,同间接法8)。
6)同间接法9)。
7)同间接法10)。
③结果判定 常用的判定方法有3种。
阴阳性表示法：待检样本吸收值：规定吸收值≥0.2－0.4 为阳性。规定吸收值等于阴性样本平均吸收值加SD(标准差)。
阳性阴性比(P/N)法：样本吸收值/阴性样本平均吸收值≥2－3者为阳性。
终点表示法：以出现阳性反应的样本最高稀释度为该样本的滴度。
④注意事项
第一,包被过程中以高pH值和低离子强度的条件为佳，包被浓度在1－100毫克/毫升选择最佳浓度。
第二,血清或抗原稀释液应含5%－10%异种动物血清, 或1%牛血清白蛋白,或0.5%明胶,以起封闭作用,防止非特异性反应,否则应在2)与3)步之间加封闭液进行封闭。
第三,洗涤要充分,酶结合物应按要求进行稀释和使用, 底物溶液一定要现配现用。
第四,显色时,阴性对照刚出现微黄色时应立即终止反应。.
第五,用阳性阴性比方法判定结果时,阴性对照孔若小于0.1,则易出现误判。
第六,用自动酶联仪检测时，应按仪器规定说明确定调零孔。
第七,同一稀释度2个孔的490纳米波长光密度值的平均值为该稀释度的光密度值,对照孔应做同样处理。
