凝集试验 凝集试验的原理是：颗粒抗原(红细胞、细菌、病毒等)与含有相应抗体的血清混合,在电解质的参与下, 则能发生特异性结合，形成抗原抗体复合物,这种复合物呈均匀状态悬浮于液体中,这时肉眼是看不见的,当抗原抗体复合物在一定浓度的电解质作用下,复合物表面的电荷大部分被消除,失去了互相排斥的作用，复合物之间互相吸引，凝集成团,即出现肉眼可见的凝集现象。作用于凝集反应的抗原,称为凝集原,与之相结合的抗体,称为凝集素。
凝集反应按其原理可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。用于猪病诊断的常用操作方法有以下几种。
(1)全血平板凝集试验 本试验在实践中主要用于细菌性疾病的抗体检测和抗原(经分离培养后)的鉴定。现举例用已知猪丹毒抗原(丹毒杆菌的纯培养液)测定被检猪血清中的抗体。其操作步骤如下：
①材料 猪丹毒凝集抗原,玻片,9号针头,酒精棉球,酒精灯,铅耳(取血环)等。
②操作 用铂耳取已知抗原1滴,置于玻片上。用酒精棉球擦拭针头,铂耳在酒精灯上灼烧消毒。用针头刺破被检猪的耳静脉,以铂耳取血与玻片上的抗原等量混合,在2－3分钟内观察结果。
③结果判定 出现颗粒状的凝集,为阳性反应。否则为阴性。
(2)试管凝集试验 试管凝集试验是一种定量法,用于测定被检血清或其他体液中有否某种抗体及其效价,可作临床的辅助诊断,或用于流行病学监测。在猪场中,本法常用于猪布氏杆菌病的诊断。
①材料 布氏杆菌病试管凝集抗原(1：20倍稀释),布氏杆菌病阳性血清、阴性血清(1：25倍稀释),稀释液(0.5% 石炭酸生理盐水),灭菌小试管,1毫升吸管,试管架,待检血清等。
②操作 取试管7支置于试管架上,设阳性和阴性血清及抗原对照各1支,测定管4支,以后每增加一个样品,只需增加4支测定管。
按
表2示意稀释血清,加抗原,完成后每支管内应含 1毫升液体。
加入抗原后,将试管充分振荡,置37℃温箱反应24小时后，判定结果。
③判定标准
"一" 液体均匀混浊,管底无凝集物,不凝集。
"+" 液体透明度较差,管底有少量凝集物,为25%凝集。
"++" 液体中等混浊,管底有中等量的伞状沉淀,50%菌体凝集。
"+++" 液体几乎透明,管底有明显伞状沉淀,75%菌体凝集。
"++++" 液体完全透明,管底出现大片的伞状沉淀,100% 菌体凝集。
结果判定：以出现50%菌体凝集的血清最高稀释度为该血清的凝集价。在检测猪布氏杆菌病时,血清凝集价在1：50以上时，可判为阳性反应，若凝集价为1：25则为可疑(需复试验1次)。如猪群中基本无阳性反应,则凝集价1：25也可判为阴性。
(3)间接红细胞凝集试验 本法简称间接血凝试验。其原理是：将抗原(或抗体)吸附在比其体积大千万倍的红细胞表面,只需少量的抗体(或抗原)就可使这种致敏的红细胞通过抗原和抗体的结合而出现肉眼清晰可见的凝集现象。这种试验能大大提高反应的敏感性。
用抗体致敏红细胞检测相应的抗原,称为反向间接血凝试验,反之,称为正向间接血凝试验。在猪病的诊断中,常采用本法对猪口蹄疫、水疱病、猪瘟、传染性胸膜肺炎等疾病抗原的鉴定,或抗体的检测。现举例猪口蹄疫的抗体检测(正向间接血凝),操作步骤如下。
①目的 检测被检血清样品中猪口蹄疫抗体的效价。
②材料 猪口蹄疫(○型)正向间接血凝标准致敏红细胞 (由兰州兽医研究所提供),标准阳性、阴性血清,稀释液,96 孔"V"型有机玻璃微量血凝板,微量加样器,滴头，被检血清等。
③操作 将待检血清置60℃水浴中灭活30分钟,用微量加样器对血凝板上的每孔加入25微升稀释液。取25微升待检血清加到第一孔,用加样器以吸人与排出的动作混合3-4次,取出25微升放人第二孔混匀,依次到第九孔,取出25 微升弃掉。血清稀释度从第一至第九孔分别为1：2,1：4, 1：8,1：16,1：32,1：64,1：128,1：256,1：512(第一排的 10－12孔设阳性血清对照、阴性血清对照和抗原对照)。每孔 加入25微升致敏红细胞,振荡1-2分钟,置37℃温箱或室温下反应1－2小时或更长时间，然后判定检测结果。
④判定标准
"一" 红细胞沉底,呈圆点状,无凝集现象。
"+" 红细胞大部分集中于中央,周围只有少数凝集,即 25%凝集。
"++" 红细胞呈薄层凝集,中心致密,边缘松散,即50%凝集。：
"+++" 红细胞凝集程度较上有所增加,即75%凝集。
"++++" 红细胞呈薄层凝集,布满整个孔底或边缘,卷曲呈荷包蛋边状,为l00%凝集。
结果判定：以出现50%凝集(++)的血清最高稀释度为该血清的间接血凝价。
(4)乳胶凝集试验(LAT) 本法在猪病中主要用于伪狂犬病和萎缩性鼻炎的诊断,是用其病毒致敏乳胶抗原来检测被检猪的血清、全血或乳汁中的抗体,具有简便、快速、特异、 敏感的优点。
①材料 伪狂犬病病毒致敏乳胶抗原,伪狂犬病阳性血清、阴性血清,稀释液,玻片,吸头,被检血清或全血或乳汁(通常采初乳,经3000转/分钟离心10分钟,取上清液作待检样品)
②试验方法
定性试验：取被测样品(血清、全血或乳汁)、阳性血清、阴性血清、稀释液各1滴,分置于玻片上,各加乳胶抗原1滴,用牙签混匀,搅拌并摇动1－2分钟,于3－5分钟内观察结果。
定量试验：先将血清在微量反应板或小试管内作连续倍比稀释,各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上,另设对照 (同上),随后各加乳胶抗原1滴。如上搅拌并摇动,然后判定。
③结果判定 首先对照组要出现如下的结果,本试验才能成立：阳性血清加抗原呈"++++"阴性血清加抗原呈"一"，抗原加稀释液呈"一"。
"++++" 全部乳胶凝集,颗粒聚于液滴边缘,液体完全透明。
"+++" 大部分乳胶凝集,颗粒明显,液体稍混浊。
"++" 约50%乳胶凝集,但颗粒较细,液体较混浊。
"+" 仅有少许凝集,液体混浊。
"一" 液滴呈原有的均匀乳状。
以出现"++"以上凝集者，判为阳性凝集。
