猪圆环病毒研究进展- 文章转自 猪易网
猪圆环病毒研究进展
(南京农业大学 潘群兴 博士)
猪2型圆环病毒是近年来新发现的病毒之一，该病毒与猪的多种疾病综合征有关，包括猪断奶后多系统衰竭综合征，猪皮炎/肾病综合征，猪增生性/坏死性肺炎，仔猪先天性震颤及母猪流产等，严重危害养猪业的健康发展，病原学及血清学调查表明，该病毒在世界各地广泛存在。
1 病毒的发现
1974年，德国学者Tischer等从多株连续传代的PK-15(ATCC-CCL31)细胞中检出一种形态学上与小核糖核酸病毒相似的小球形病毒和乳多泡病毒样病毒粒子，当时认为它是一种细胞污染物，可以持续感染PK-15细胞，但不引起细胞病变。1982年，Tischer等进一步证实，PK-15细胞中存在的这种病毒来源于当初制备PK-15细胞的猪肾组织，因该病毒的基因组由单股环状的DNA组成，故将其命名为猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)。PCV在分类上属于圆环病毒科(Circoviridae)，圆环病毒属(Circovirus)。圆环病毒科是国际病毒分类委员会(ICTV)第六次学术报告新增病毒科，该科病毒的共同特征为病毒粒子无囊膜，基因组由一条单股、环状的DNA链组成。被列入该科的病毒既有植物病毒，又有动物病毒，其中植物病毒有地三叶草侏儒病毒(SCSV)，椰树叶腐烂病毒(CFDV)、香蕉簇顶病毒(BBTV)等；动物病毒有鸡传染性贫血病病毒(CAV)，鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)、猪圆环病毒(PCV)、鸽圆环病毒(CoCV)、金丝雀圆环病毒(CaCV)、人的TT病毒(TTV，一种肝炎病毒)等。圆环病毒科内尚无具体的分属标准，Niagro等[1]建议可将圆环病毒分为3个类群：似双病毒类嗜动物圆环病毒，包括PBFDV和PCV；似双病毒类嗜植物圆环病毒，包括SCSV、CFDV和BBTV；CAV与其它圆环病毒的结构差异较大，被列为另一类群。
Allan等[2]从患流产或死胎病例的胎儿组织中检测到PCV病毒，同时他们还从患先天性震颤的仔猪体内大量分离到PCV病毒，但用该病毒试验性感染猪后却没有出现任何临床症状，因此认为该病毒对猪没有致病性，这一结论与Tischer等[3]的研究结果相一致。此后，一种被称为猪断奶后多系统衰弱综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的新病出现，该病最早于1991年在加拿大西部发现[4-6]，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热及黄疸等[7-10]，相似的疾病相继在美国[11]、法国[12]、西班牙[13]、北爱尔兰[14]等国出现。Lecann等[12]报道：自1995年始，在法国布列塔尼约100个猪群中的8-13周龄猪，发生猪断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)，感染猪表现为肌肉衰弱无力、下痢、呼吸困难，表现症状后2-8天内部分猪出现死亡，约有50%左右的猪存活，但存活猪生长发育不良。用发病猪的肺、淋巴结组织超滤液人工接种仔猪时，发现与接种猪接触的仔猪出现了临床症状，从发病猪的淋巴组织中分离病毒时，发现了PCV病毒颗粒，同时用PCR方法从发病猪淋巴组织及人工感染仔猪的鼻腔分泌物和粪便中检测到了PCV的DNA。Segales等[13]也报道从患PMWS病猪的淋巴组织和肺中检测到了PCV特征性核酸。Nayar等[10]和Ellis等[15]从含有PCV抗原和核酸的PMWS感染猪组织中分离到PCV病毒。Nayar等[10]利用限制性内切酶酶谱进行分析发现从PMWS病例中获得的PCV DNA限制性内切酶酶型与其它来源的没有致病性的PCV限制性内切酶酶型不同。Allan等[7]采用间接免疫荧光试验证实：从有PMWS症状猪体内分离的PCV，彼此间抗原性相似，但与传统的持续感染PK-15细胞的PCV及PCV北爱尔兰株[2]有很大的区别。随着与疾病相关的病毒抗原和核酸的证实，有学者推测在多个国家出现的这种病毒可能是一种新的、或者是被修饰的具有致病性的猪圆环病毒[7,12,15,16,17]。该病毒在核苷酸水平上形成了一种关系密切的种属，种内核苷酸同源性大于96%，但与PCV PK-15株的同源性仅有70%左右。根据PCV在致病性、抗原性及核苷酸序列上的差异性，他们建议将从有PMWS症状猪体内分离到的有致病性的这类PCV定为2型，而将污染猪肾传代细胞的PCV PK-15及没有致病性的这类PCV定为1型[16,18]。
2病毒的理化特性
猪圆环病毒(PCV)是兽医学上已知动物病毒中最小的病毒，该病毒的病毒粒子呈二十面体对称，直径约17 nm，PCV1在CsCl中的浮密度为1.37 g·cm3 -1，沉降系数为52 S[19]。该病毒的病毒粒子无囊膜，由衣壳蛋白和基因组组成。病毒的衣壳蛋白为一条多肽链，其分子量约为28 kDa。病毒的基因组是一条共价结合形成的闭合环状的单链DNA，长约1760 bp。PCV1不能凝集人及其它动物红细胞。病毒对外界环境的抵抗力较强，在酸性环境(pH3)及氯仿中可以存活较长时间，在高温环境(56℃)也能存活一段时间[20]。
3病毒的增殖特性
PCV体外培养特性与猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）相似，适于在具有旺盛增殖能力、并处于有丝分裂过程中的细胞上复制。Allan等证明PCV在源于猪骨髓、外周血液、肺洗出物和淋巴结的单核细胞/巨噬细胞中复制。牛外周血液来源的单核细胞也对PCV感染敏感。PCV在原代猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞及一些猪传代细胞系PT、PET上不能生长，在PK-15细胞、猪睾丸传代细胞系(ST)及Vero细胞上可以生长，但不引起细胞病变。Tischer等[21]报道在接种PCV 的PK-15细胞培养物中加入300 mmol·L -1的D-氨基葡萄糖处理细胞30 min，可以促进病毒DNA进入细胞核，从而提高病毒的复制，使得感染PCV的细胞数量提高30%。但是，D-氨基葡萄糖对细胞有毒性作用，因此处理过程必须要小心谨慎[22]。
感染PCV的PK-15培养细胞内含有许多细胞浆内包涵体，少数感染细胞内还含有核内包涵体。大多数胞浆内包涵体分布于细胞核周围，呈圆形或卵圆形。胞浆内包涵体分为两种类型：一种形态较小(直径0.1 mm-0.5 mm)，无膜包围，呈颗粒状，其周边与细胞质融为一体；另一种包涵体较大(直径0.5 mm-5.0 mm)，有膜包围，电子密度较大。核内包涵体无膜包围，常与网状核仁或异染色质的凝集物结合，呈圆形、铃形或颗粒状，大小为0.1 mm-1.0 mm[23]。
4病毒的分子生物学研究进展
4.1 PCV基因组结构
PCV有两种基因型：PCV1和PCV2。前者基因组为1759 bp，后者基因组为1768 bp或1767 bp，两者都含有两个主要的开放阅读框：ORFl和ORF2。PCV1有7个ORFs，均编码大于5 kDa的蛋白质。PCVl的ORF1编码病毒的复制蛋白，序列分析发现，该蛋白在所有圆环病毒之间高度保守[24,25]。Gibbs等[26]通过系统发育树分析发现，圆环病毒的Rep蛋白与植物矮小病毒和二价染色体病毒之间有一定的同源性，据此，作者推测该蛋白可能起源于植物矮小病毒，经过宿主转移感染脊椎动物，并与其它感染脊椎动物的病毒发生重组从而成为能感染脊椎动物的圆环病毒。对PCV2的基因组分析发现：所有PCV2分离株的基因组同源性都在95%以上，但与PCV1的核苷酸同源性却小于80%。PCV2通常含有11个ORFs，预计分别编码1.8-35.8 kDa的蛋白质，各阅读框大小相差悬殊，其中ORF1、ORF5、ORF7、ORF10在病毒链上，而ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORFll在互补链上[27]，这些基因表现为重叠基因，从而充分利用了病毒有限的遗传物质。对PCV1和PCV2的ORFl分析发现二者核苷酸和编码蛋白的同源性分别为83%和86%，但ORF2的同源性却分别只有67%和65%[18]，ORF3的氨基酸同源性为61.5%-62%，ORF4的氨基酸同源性为83%[27]。
Hamel等[27]研究发现：在PCV1和PCV2的保守区段都包含有Ploy(A)信号，在病毒链上，PCV1的Ploy(A)分别位于:314 nt-319 nt，973 nt-978 nt；PCV2的Ploy(A)分别位于：327 nt-332 nt、983 nt-998 nt。在互补链上，PCV1有两个Ploy(A)信号分别位于：1015 nt-1030 nt，1184 nt-1189 nt；而PCV2只有一个Ploy(A)信号位于1022 nt -1027 nt。经氨基酸序列分析发现，PCV1编码蛋白中包含3个糖基化位点，分别位于ORFl编码蛋白的20 aa-22 aa(NPS)，ORF2编码蛋白的102 aa-104 aa(NYS)以及ORF4编码蛋白的34 aa-36 aa(NCS)；而PCV2的编码蛋白中包含有5个糖基化位点，分别位于ORFl编码蛋白的23 aa-25 aa(NPS)、256 aa-258 aa(NQT)和286 aa-288 aa (NAT)，ORF2编码蛋白的143 aa-145 aa (NYS)以及ORF4编码蛋白的30 aa-32 aa (NVT)。
4.2基因进化分析
温立斌最早应用RFLP技术对PCV2进行基因分型，发现国内流行的毒株可以分为A～I 9个型[28]。近年来，基于基因进化分析软件，国内外许多研究者对大量PCV2分离株进行了进化分析。Olvera等[29]研究发现利用ORF2基因可
以构建出与全基因相似的进化树，因此今后的进化分析可以用ORF2的序列信息代替全基因序列，这也节省了克隆测序的工作。综合各研究结果，目前世界流行的PCV2主要可分为两个大的基因型和若干亚型，但是不同的研究者采用了不
同的命名，如group 1／2，I／II，321／422，SG3／SG1／SG2，A／B等，这对进一步的研究造成了影响，最近，许多研究者共同决定把这一命名标准化为PCV2a、2b和2c，PCV2c目前仅在丹麦被发现 。PCV2a、2b的Cap蛋白在86～89 aa存在特定的基序可供识别这两种型，分别是TNKI和SNPR(L)。此外根据基因组的长度也可以区分，PCV2a、2b分别为1 768和1 767 bp。根据Olvera等的原则，PCV2a包括2A、2B、2C、2D、2E亚型；PCV2b包含1A／1B、IC亚型[30]。有研究表明PCV2b比PCV2a具有更强的致病力，但该假设有待进一步证实。目前，我国国内流行的毒株以PCV2b为主[31] 。
5与PCV2相关疾病
5.1猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)
PMWS(post-weaning multisystemic wasting syndrome)可见于5-16周龄的猪，但最常见于6-8周龄，即断奶猪群。猪群患病率为3%-50%，死亡率为8%-35%。本病有六大主要临床症状，分别为消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大、腹泻、苍白及黄疽[5,6,66,82]。其它临床症状，包括咳嗽、发热、胃炎、脑膜炎及突然死亡也有报道，但较少见[82,83]。在少数情况下，当疾病严重流行时可使断奶仔猪的死亡率增加3-4倍。疾病的持续高死亡率在欧洲更为普遍，这可能与疾病的流行模式有关，也可能与其它疾病的混合感染以及当地独特的养猪模式有关。Madec等[84]报道，如果将保育舍每栏猪限制在31头以下时，疾病的感染率虽高，但死亡率却降低。在剖检病变方面，病猪表现消瘦，有不同程度的肌肉萎缩。最主要的变化是全身淋巴结，特别是腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结及下领淋巴结肿大2-5倍，有时可达10倍，切面硬度增大，可见均匀的苍白色[14,76,77]。集合淋巴小结也肿大，若发生细菌二次感染，则淋巴结可见炎症和化脓病变，使病变复杂化[3,78]。肺肿胀，坚硬或似橡皮，表面点缀有灰褐色斑块，严重时表现为肺泡出血，颜色变深，间叶和心叶萎缩或实变：脾肿大，呈肉样变化，其切面无充血变化，外表呈花斑状；肝脏变暗，萎缩，肝小叶间结缔组织增生；肾脏水肿，苍白，被膜下有白色坏死灶；心包膜内有大量炎性渗出物；食道、胃出现不同程度的溃疡，盲肠、结肠粘膜充血或淤血[4]。以上病变可能很难在同一头感染猪上同时见到，因此，要在同群感染猪中广泛采集病料。临床感染猪可能在一个器官系统出现病变，而在其它器官不出现病变，这可能与继发感染有关，也可能与PCV毒力、组织嗜性、感染时期，宿主本身特点及其免疫应答不同有关[22]。
在组织学病变方面，淋巴结和肺脏是PCV2的主要靶器官。淋巴组织器官包括淋巴结、扁桃体、胸腺、脾脏及集合淋巴小结等，其主要病变表现为淋巴细胞减少，单核吞噬细胞浸润，最为显著的特征是形成合胞体性多核巨细胞及细胞质内包涵体，包涵体大小为5 mm-25 mm，圆形，界限分明，均质的嗜碱性或两性染色，核质反应阳性，在细胞中单个存在或多个集合成葡萄串状；淋巴结的皮质区内由于单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞的高度浸润而显著扩大；淋巴滤泡中心有蜂窝状坏死，其周围形成由组织细胞、类上皮细胞性巨噬细胞、多核巨细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞集聚的炎性肉芽肿[8,77]。肺脏有轻度多灶性或严重的弥漫性间质性肺炎，肺泡隔显著肥厚，肺泡内有单核细胞、嗜中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸润，有时浸润细胞破坏了正常组织结构；部分肺的支气管、血管有淋巴细胞、组织细胞浸润，偶尔出现多核巨细胞脚[7,77]。肝脏最常见到门脉周围淋巴细胞、组织细胞浸润，具有以窦状隙内单核炎性细胞集聚和肝细胞脱落为特征的肝炎病变；慢性死亡病例，由于黄疽而使肝小叶周围纤维化，肝细胞坏死、消失及单核细胞弥漫性浸润[77]。肾脏有轻度乃至严重的多灶性间质性肾炎，主要在皮质部发生淋巴细胞、组织细胞浸润，少数病例有肾盂炎、急性渗出性肾小球炎[12]。心脏多有以炎性细胞浸润为特征的轻度至中度的多灶性心肌炎；胃、肠肌层有不同程度的炎症；少数病例可见非化脓性脑炎，轻度的多灶性淋巴细胞、浆细胞浸润性肾上腺炎及各部组织的局部性肉芽肿性血管周围炎[7,77]。
5.2猪皮炎/肾病综合征(PDNS)
PDNS(porcine dermatitis and nephropathy syndrome)是一种以系统性血管炎为特征的主要侵害猪体皮肤和肾脏的一种传染病，该病首次报道于英国[85,86]。 Allan等[87]研究发现，在新西兰1990年就已经有该病存在。PDNS主要发生在保育猪及育肥猪，目前，在世界各养猪国家关于该病的报道越来越多。该病最常见的临床症状是在患猪皮肤表面出现圆形或不规则形的、颜色由红色到紫色的斑块，这种病变常见于臀部、四肢及腹部，但也可能发展到胸部、侧腹部及耳部。轻度感染动物不发热，大多数可以自动痊愈。严重感染动物除了以上的皮肤病变外，还表现皮下水肿、跋足、发热、厌食、精神萎靡、消瘦、呼吸困难或呼吸急促以及苍白等症状。也有突然死亡病例，但很少。PDNS的特征性病变是皮肤发生系统性的坏死性血管炎及肾脏出现纤维蛋白坏死性肾小球性肾炎。肉眼病变主要表现为肾脏肿大、苍白，表面常有淤血斑。显微病变主要表现为Ⅲ型过敏反应，即免疫复合物在血管和肾小球的毛细管壁沉积而引起的免疫介导性障碍[88,89]。在淋巴结中，淋巴细胞的轻度或大量缺失在PDNS病例中也经常见到，有50%PDNS感染猪的淋巴结，特别是淋巴滤泡区域可见组织细胞或多核巨细胞的肉芽肿性炎性浸润[90,91]。此外，PDNS感染猪的另一个常见病变是感染猪出现间质性肺炎[90]。
对引起免疫介导性障碍起作用的抗原尚不清楚，理论上讲，有很多因素包括药物、化学药品、食物中的变态反应原、机体的内源性抗原及病原微生物等可能参与了这一过程[88]。目前，许多学者都认为病原微生物在PDNS免疫介导性障碍发生中所起的作用较之其它因素要大，并且，在这些微生物中，PRRSV和PCV2最可能是引起免疫介导性障碍的抗原[90,92]。但在PDNS感染猪发生血管炎和肾小球肾炎部位却未检测到病毒的抗原及核酸[94]。现有的研究结果表明，有多个因素，如PCV2[90]，PRRSV[91,92]、多杀性巴氏杆菌[93,94]及链球菌[95]可能参与了PDNS的发展。Wellenberg等[96]的研究结果表明，无论是流行病学数据，还是病原学和血清学数据都说明PCV2在PDNS中起作用：(a) PDNS发生在以前爆发过PMWS的猪群；(b) 在发生PDNS猪群，PMWS也同时发生，Gresham等[97]也报道了PMWS和PDNS之间具有一定的相关性；(c) 从免疫病理学上也证实了二者的相似之处，如，二者都出现淋巴结肿大、出血，合胞体形成及间质性肺炎等[90,91]。(d) 在英国[97]和荷兰[98]进行的流行病学调查表明，PDNS发病率增长时，PMWS发病率也同时增加。此外，在此项研究中，作者还发现在所有PDNS感染猪中都能检测到PCV2 DNA和高滴度的PCV2抗体。此项研究也同时证实PPV和PRRSV不是PDNS的原发性病原，二者可能作为一种共感染因子对PDNS的发展起一定的作用。Segales等[99]认为，需对PCV2在世界各地的大量PDNS感染猪中的感染状况进行深入研究，以确定PCV2是否参与PDNS的发生及其在PDNS发生中的致病机制。
5.3 PCV2相关性繁殖障碍
PCV2相关性繁殖障碍最早于1999年在加拿大西部的两个猪群发现[74,100,101]。类似疾病后也相继在美国爱荷华州和欧洲西部发生[102,103]。该病主要表现为发病母猪发生流产、严重的死胎、木乃伊胎增加、新生仔猪死亡及断奶后仔猪死亡率增加。在死产和新生仔猪中最常见的病理损害为：肝脏出现慢性淤血，心脏出现心肌肥大及严重的非化脓性至坏死性或纤维素性心肌炎，并且通过PCR、免疫组化及病毒分离发现PCV2在流产胎儿及新生感染仔猪的心脏和肝脏中大量存在，偶见于肺脏和肾脏[74,101]。
Pensaert等[104]认为，PCV2感染母猪后可使母猪产生病毒血症。病毒血症有两种类型，一种是细胞相关性病毒血症，一种是非细胞相关性病毒血症。为了证实PCV2引起的病毒血症的类型，Pensaert等[104]对PCV2感染母猪的血浆和PBMCs中的感染性病毒及病毒DNA的量进行研究发现，在血浆中，仅在感染后21 d出现PCV2感染性病毒，在感染后14 d-49 d可检测到病毒DNA；而在PBMCs中，在感染后14 d-49 d出现PCV2感染性病毒，在7 d-63 d可检测到病毒DNA。由此可以看出，PCV2引起的病毒血症既有细胞相关性病毒血症，又有非细胞相关性病毒血症，但主要以细胞相关性病毒血症为主。对于细胞相关性病毒血症出现的意义尚不清楚，但值得注意的是，细胞相关性病毒血症的出现同时伴随着PCV2血清抗体的出现，这就说明有可能是由于PCV2抗体的出现减少或中和了血浆中的病毒，从而使细胞相关性病毒血症占主要地位，然而，在PCV2抗体出现之前血浆中为何也检测不到感染性病毒，这一点同样值得研究。
Sanchez等[105]通过对妊娠57 d，75 d和92 d的母猪体内胎儿进行PCV2接种证实，PCV2可以在胎儿体内复制，并引起组织病变，心脏是猪胚中PCV2增殖的主要靶器官。Sanchez等[106]进一步证实心肌细胞是病毒的主要靶细胞，并且PCV2在胎儿体内的复制与妊娠时间有关，在妊娠57 d接种PCV2的胎儿，其各组织器官中的病毒抗原阳性细胞数及病毒滴度较妊娠75 d和92 d的胎儿高，并且仅在妊娠57 d的胎儿出现肉眼可见的组织病变，其特征主要表现为水肿、充血和出血，这可能是病毒大量复制所造成的结果。病毒能在妊娠57 d的胎儿体内大量复制，这可能与此时胎儿缺乏免疫能力有关。同时，PCV2抗体仅在妊娠75 d和92 d的胎儿体内检测到，这些抗体的出现限制了PCV2在胎儿各组织器官中的复制，使得各组织器官中的病毒含量减少，因此在这些胎儿中见不到病变。此外，在感染后21 d，未接种PCV2的胎猪体内检测不到病毒及其抗体，表明病毒在子宫内不会迅速传播。PCV2相关性繁殖障碍主要发生在母猪，但尚未发现繁殖障碍与PMWS或PDNS在发病猪群中同时爆发的情况。然而，在不吮初乳的仔猪爆发了PMWS[107,108]，由此推测垂直传播是可能的。PCV2经公猪精液排出已经证实。因此，了解PCV2在繁殖障碍中的流行病学，对保持猪群良好的繁殖性能将具有深远的意义。
5.4猪呼吸道病复合症(PRDC)
猪呼吸道病复合症(porcine respiratory disease complex，PRDC)是一种严重危害生长育肥猪的疾病。该病主要发生于16-22周龄的猪，其临床症状主要表现为生长缓慢、饲料利用率降低、嗜睡、厌食、发热、咳嗽以及呼吸困难[109,110]等。其组织学特征是患猪出现亚急性到慢性肺炎病变，主要表现为肺部广泛性的肉芽肿性炎症、多核巨细胞的形成及在炎性细胞和巨噬细胞中出现大量的嗜碱性胞浆内包涵体，在病变部位存在大量PCV2核酸及抗原[111,112,114,115]。PRDC和PMWS无论是在临床症状，还是在病理变化上均有所不同，二者虽都具有肺炎症状，但PRDC通常在非呼吸道组织中没有特征性病变。从病理学上讲，一种被称为增生性/坏死性肺炎（proliferative and necrotizing pneumonia，PNP）的疾病因其也属于呼吸系统疾病，因此，也被列入猪呼吸道病复合症。对于PNP，该病最早于1992年在加拿大魁北克省出现[116]。PNP的特征性组织病理学变化主要表现为肺泡中出现坏死细胞、大量巨噬细胞及蛋白样物质、Ⅱ型肺细胞增生及坏死性细支气管炎；偶尔可见肺泡中出现大量多核巨细胞及单核细胞浸润引起的肺泡隔变厚的现象。最初，学者们都认为PNP是猪流感(SIV)和PRRSV混合感染的结果[117,118,119,120]。后来，Clark等对加拿大东部出现的典型PNP病例进行免疫组化分析发现，在这些病例中PCV2普遍存在，偶尔与PRRSV和其它病原发生共感染。另有两项研究表明PCV2 DNA和抗原在支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞中大量存在，而PRRSV在这些组织中数量很少，并且仅限于巨噬细胞中。同样，对美国中西部PRDC病例进行免疫组化研究发现，在患有肺炎的病例中有许多PCV2和PRRSV共感染病例存在，但在患猪肺组织中PCV2占绝对优势；作者也同时发现有PCV2和SIV及猪肺炎支原体共感染的病例出现[117]。此外，Kim等[114]对韩国105头PRDC患猪进行了病原学检测，结果有85头为PCV2阳性，66头为PRRSV阳性，38头为多杀性巴氏杆菌阳性，33头为猪肺炎支原体阳性，在这些病例中有80头共感染病例和25头单独感染病例存在。在对PCV2和PRRSV感染引起的肺炎及其它系统疾病进行研究发现，PCV2和PRRSV共感染比单独感染时引起的疾病更严重[117,121]。以上研究可以证实，PRDC是多种呼吸道微生物混合感染的结果，这些微生物包括PCV2、PRRSV、SIV、猪肺炎支原体及多杀性巴氏杆菌等，这些微生物间的协同作用对PRDC的发展非常重要。虽然PCV2所起的作用究竟是一种主要病原体、协同病原体，还是继发或机会性病原体尚不清楚，但在PRDC病例的肺脏病变部位存在PCV2 DNA，这暗示PCV2在PRDC发生中可能起重要作用。
5.5先天性震颤及中枢神经系统疾病
先天性震颤(congenital tremors，CT)是发生在新生仔猪的一种疾病，其特征表现为新生仔猪的头部及四肢发生震颤[122]。根据中枢及外周神经中髓磷脂的出现与否，可以将先天性震颤分为两个类型，出现髓磷脂的被称为A型，而没有髓磷脂的被称为B型。此外，A型先天性震颤又可分为5个不同的亚型(AI-AV)[122]。Hines and Lukert[64]首次报道了PCV与Ⅱ型先天性震颤之间存在一定的潜在联系。这些研究早于PMWS的发现和PCV2的鉴定，近年来的研究结果进一步证实了这些早期的报道。Stevenson[123]用PCV2原位杂交和间接免疫荧光试验发现，在患先天性震颤猪的小脑、大脑及脊髓部神经元中存在大量PCV2。然而，对曾经爆发过先天性震颤的4个不同猪场的猪进行研究发现，无论是CT感染猪，还是健康猪都没有任何肉眼及显微病变，但在所有猪的神经组织及肝脏中都可检测到PCV核酸[124]。最近，Kennedy等[125]对欧洲CT病例进行的研究也证实PCV2与AⅡ型先天性震颤无关。目前，PCV2与AⅡ型先天性震颤是否有关是一个有争议的问题，需要进行进一步的研究以阐明PCV2在CT发生中的作用。在与PCV2有关的其它疾病的研究中，Wellenberg等[83]报道，在患PMWS猪的脑膜及大脑病变部位也存在少量的PCV2。以上这些报道说明，研究PCV2与中枢神经系统疾病之间关系的重要性，也可以解释在某些PMWS发生地区为何会出现猪突然死亡的病例。
6.PCV2的致病机理
目前的研究表明，PCV2主要在机体的单核/巨噬细胞中复制，少数可在肾小球、支气管上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和淋巴细胞中增殖。尽管在PMWS严重发病猪体内淋巴细胞显著缺失，但几乎不能或者很少能从淋巴细胞中检出PCV2核酸及抗原。从定量的观点看，与其它类型的细胞相比，单核/巨噬细胞系统中PCV2的含量最多，然而PCV2核酸和抗原主要从PMWS患猪组织的巨噬细胞、树突状细胞和多核巨细胞的细胞浆中检测到，极少在细胞核中检测到。血细胞和其它上皮细胞或内皮细胞的细胞核内存在病毒标记物，表明这类细胞可能在病毒的产生过程中发挥重要作用。而单核细胞/巨噬细胞胞浆内存在的抗原和核酸是否是其吞噬所致，以及骨髓中单核细胞/巨噬细胞前身在病毒增殖中的作用，这些都需进行进一步探索。
毫无疑问，PCV2与免疫系统及其分子成份间存在相互作用，但这种相互作用在感染的早期是如何发生的，以及这种相互作用是发展成为PMWS还是成为亚临床和持续感染，尚不清楚。在PCV2感染过程中，免疫系统似乎是一把双刃剑。一方面，PCV2与其它病毒，如PRRSV和PPV同时接种试验猪时，这些病毒可以刺激和活化免疫系统，从而促进感染猪体内PCV2的增殖。因此，免疫系统的激活可能是PMWS的触发因素。另一方面，PCV2感染也使机体产生严重的淋巴组织病变，包括淋巴细胞的缺失及淋巴组织免疫细胞亚群的变化，这就使机体的免疫力下降，从而对其它病原不能产生有效的免疫应答，也是该病发生机理的重要部分。
6.1免疫刺激
目前已证实，PCV2可引起猪发生PMWS[7,59,72,126]。PCV2感染可能是引起PMWS的主要原因，但不是唯一的原因，有些PMWS病例还有PPV，PRRSV等的共同感染。Allan等[72]研究表明，用PCV2单独感染或PCV2与PPV混合感染未吃初乳的仔猪，可使猪表现PMWS临床症状及病理变化，混合感染较PCV2单独感染严重，可引起试验猪死亡，而单独感染PPV的试验猪不表现任何临床症状和病理变化。Allan等认为PCV2与PPV对猪都具有较强的感染性，在自然界中都广泛存在，因此，两者混合感染引起PMWS的可能性较大。Ellis等[68]将PMWS患猪的组织病料及其细胞分离物接种限菌仔猪，接种物中起初被证明只含有PCV2，但从复制出的PMWS猪的组织病料中却分离出了PCV2及PPV，只不过PPV的含量较少，对此研究结果，Ellis等认为PMWS是PCV2与PPV混合感染的结果，过去所报道的一些PMWS病例中，之所以只分离到PCV2而没有发现PPV，可能是由于PPV在患猪组织中的含量较少，同时PPV对PK-15细胞也不太敏感所致。由于这两种病毒都可以感染巨噬细胞，并且其复制都需要细胞周期的S期表达的细胞酶类，有可能是PPV在感染巨噬细胞时使巨噬细胞活化，从而促进PCV2的复制，同样，也可能是其它未知因素促进了这两种病毒的复制。对于PCV2与PPV的这种协同作用机理尚不清楚。相似的问题在PCV2与PRRSV中也存在，因为PRRSV也在巨噬细胞中复制。PRRSV感染是世界性的普遍问题，而且PCV2和PRRSV共感染的发生率在PMWS，PDNS及PRDC中很高。如果PPV和PRRSV刺激了免疫系统并且促进了PCV2的复制，可以假设，其它非传染性刺激原与PCV2共同作用同样可以加重PMWS症状及病变。Krakowka等[127]将PCV2感染新生仔猪后，再注射弗氏不完全佐剂乳化的钥孔戚血蓝蛋白(KLH/ICFA)，可使PCV2感染仔猪出现明显的PMWS症状及病变，而未注射KLH/ICFA组则未发生PMWS。因此，免疫刺激在PMWS的发病过程中可能起着关键性的作用。这一点对实际生产有很大的指导作用。在希腊进行的田间试验证明疫苗免疫或非特异性免疫调节剂可以影响PCV2自然感染猪的PMWS症状及病变。该研究是从PMWS爆发期间的某猪场选择84头临床健康猪，分为3组，每组28头，第1组在7日龄和28日龄分别接种猪支原体肺炎疫苗，在42日龄肌肉注射PBS；第2组在7日龄肌肉注射PBS，而在28日龄和42日龄注射非特异性免疫调节剂；第3组在7，28和42日龄分别注射PBS，作为对照组。结果在接种猪支原体肺炎疫苗组有42.9%的猪发生了典型的PMWS临床症状，在注射免疫调节剂组有50%的猪发生PMWS，而对照组只有10.7%的猪发生PMWS。因此，我们可以得出结论，通过注射疫苗或免疫调节剂等非特异性刺激免疫系统，可以促进PCV2的复制，在PMWS爆发期间可以加重PMWS临床症状。
6.2免疫抑制
PCV2感染引起机体的免疫抑制，也是其致病机理的重要部分[128,129]。在PMWS研究中，有许多研究结果都对该病的免疫抑制特征进行了描述，主要表现为：①对抗生素治疗无效[6,13]；②同窝效应的存在(84)；③其它疾病综合征的同时存在[84,130,131,132]；④通常被认为是无致病性病原体的感染[4,133,134]，这些都与免疫缺陷病的特征相符。
McNeilly等[135]研究了PCV感染对猪肺巨噬细胞体外免疫功能的影响，结果发现，从整个感染过程来看，PCV感染对抗体Fc段及补体受体的表达或对巨噬细胞的吞噬作用及其辅助杀伤作用均无任何影响。在此研究中，作者所用的PCV病毒是来自持续感染该病毒的猪肾传代细胞，经过多次传代后病毒的毒力可能减弱，因此，PCV感染对猪肺巨噬细胞免疫功能无影响，有可能是因为病毒的毒力减弱所致，也可能是因为PCV本身就对猪肺巨噬细胞免疫功能无影响造成。但作者也观察到PCV感染对巨噬细胞有短暂性的影响，PCV感染后2 d可明显的抑制巨噬细胞介导的、分裂素诱导的淋巴细胞增殖，PCV感染后4 d可增加细胞MHC-Ⅰ类抗原的表达量，但表达MHC-Ⅰ类抗原的细胞总量与对照组相比无差别，此时，MHC-Ⅱ类抗原的表达量不变，而在感染后8 d可降低细胞MHC-Ⅱ类抗原的表达。现有的研究表明，MHC-Ⅰ类抗原及MHC-Ⅱ类抗原表达量的降低可能与病毒感染细胞时病毒介导的细胞膜的凹陷及病毒从细胞浆内向复制中心的移动有关。
Segales等[136]用流式细胞仪对自然感染PCV2猪外周血单核细胞进行研究发现，患猪外周血单核细胞数量较正常对照组明显增多，且出现少量未成熟粒细胞，而T淋巴细胞(主要CD4﹢和B淋巴细胞)数量下降，说明急性感染PCV2患猪不能产生有效的免疫应答。但Darwich等[137]对PCV2阳性和阴性的消瘦猪群的外周血单核细胞同时用流式细胞仪进行检测发现，所有消瘦猪无论是PCV2阳性还是PCV2阴性猪，其CD4﹢细胞都下调，这可能暗示CD4﹢细胞下调与猪的消瘦相关。而对外周血T细胞亚群的研究发现，外周血中CD8﹢T细胞和CD4﹢CD8﹢T细胞数量下降仅见于PCV2感染猪，这表明CD8﹢T细胞和CD4﹢CD8﹢T细胞变化与PMWS发展过程有关。CD8﹢T细胞的主要作用是参与细胞毒性反应，因此，应对PMWS感染猪的一般细胞毒性反应和病毒特异性的细胞毒性反应进行进一步研究。CD4﹢CD8﹢T细胞是成熟的淋巴细胞，其主要功能是起记忆细胞和效应细胞的作用[138]。因此，CD4﹢CD8﹢T细胞的变化可能干扰机体的免疫记忆反应。关于PCV2感染猪外周血中IgM﹢细胞的变化也有报道[136,139,140]。Shibahara等[140]认为IgM﹢细胞减少可能是导致PCV2感染猪的B淋巴细胞发生凋亡的原因。Darwich等[137]研究表明，依据外周血中IgM﹢细胞水平的不同，可以将PCV2阳性猪分为两类：一类是IgM﹢细胞比例<5%的猪，另一类是IgM﹢细胞比例>5%的猪。经分析已证实，5%临界值与感染猪组织中PCV2 的含量及病变的严重程度有很大关系，因此，可以将5%的IgM﹢细胞比例作为评价PCV2感染严重性的指标。此外，淋巴组织中PCV2数量与这些组织的细胞衰竭程度呈正相关，而与外周血中IgM﹢和CD8﹢细胞数量呈负相关，这同样说明PCV2感染降低了患猪的免疫应答。通过免疫组化研究发现，患PMWS猪的腹股沟淋巴结变化分三个阶段，初期和中期阶段淋巴细胞萎缩，淋巴细胞减少，滤泡间树突状细胞数量减少，B细胞和CD4﹢T细胞减少或缺失；后期淋巴结基质成份出现；同时还发现PCV2引起抗原提呈细胞的提呈能力下降，B细胞和CD4﹢T细胞功能减弱。
在细胞因子的产生方面，Sipos等[141]对PMWS感染猪的细胞因子mRNA及蛋白质水平进行的研究表明，感染猪的IL-1a及IL-10的表达量增加，这一点与Darwich等[142]的研究结果相一致，以前的研究表明，IL-10 mRNA表达水平升高仅发生在胸腺和扁桃体，但Sipos等发现，感染猪的外周淋巴细胞中IL-10表达水平也很高，这表明IL-10的过量表达不仅局限于胸腺，它也可能是免疫反应向对机体不利的方向发展所必须；IL-10及IL-6在蛋白质水平上的增加可以为单核/巨噬细胞系统的激活提供依据；在mRNA水平上，IL-8及TNF-a微量升高，而这两种细胞因子与炎性反应的发生有关；在mRNA水平上，IL-2显著降低，而在蛋白质水平上，IL-2表达量增加，从这一点可以看出，细胞内细胞因子的检测结果可以反应其它细胞的功能，即虽然细胞内的IL-2 mRNA转录水平很低，但在其它细胞的作用下促使更多的淋巴细胞产生IL-2，从而使IL-2的表达量升高；在蛋白质水平上，IFN-γ表达量降低，而在mRNA水平上，IFN-γ微量升高，说明产生Thl型保护性免疫反应的能力降低，这与Nielsen等[143]的研究结果相符；IL-4可以促进细胞介导的Th2型免疫反应，感染猪IL-4表达量降低可能暗示特异性体液免疫水平的降低。
Shibahara等[140]研究发现PCV感染在淋巴器官引起的特征性组织学病变是：淋巴细胞缺失、巨噬细胞增多及出现细胞浆内包涵体，这一点与以前的报道相同[8,14,63,78]。此外，在这些组织常发生B淋巴细胞凋亡，更为重要的是，作者发现PCV抗原和病毒粒子被限制在巨噬细胞吞噬的凋亡小体中，并且凋亡小体中无其它病原微生物存在。这些结果表明PCV可诱导B淋巴细胞凋亡并导致B淋巴细胞缺失和猪的免疫抑制。结合以前的研究结果[144,145]Shibahara等推测，PCV感染引起猪免疫抑制的致病机理：PCV直接感染分裂期细胞，包括B细胞和巨噬细胞，并通过细胞间传播直接引起单个B细胞凋亡，不能诱导巨噬细胞凋亡或坏死。含PCV的淋巴细胞凋亡小体在生发中心被巨噬细胞和巨细胞吞噬作为一种传染源感染其它细胞或通过淋巴结转移，这个过程在整个感染期都存在，甚至在感染早期及无症状期也存在。巨噬细胞吞噬凋亡细胞后，凋亡小体中的病毒粒子可自发地转染巨噬细胞，导致新的病毒粒子的产生[23]。淋巴器官中大量B细胞凋亡可能是PCV致病机制之一，并且也可以用来解释PCV感染猪后B细胞为何会剧烈减少。大量B细胞凋亡使机体的免疫力下降，继而造成其它病原，如PPV、PRRSV的继发感染，从而使PCV感染猪出现更严重的临床症状。PCV与可以引起免疫抑制的鸡传染性贫血病病毒(CAV)属于同一个病毒家族。对CAV的研究已证实，它可以编码一种凋亡素蛋白，这种蛋白可诱导人的各种肿瘤细胞发生凋亡，但不能使正常细胞发生凋亡[144]。据此，Shibahara等[140]推测PCV可能编码一种类似凋亡素的物质从而诱导B淋巴细胞凋亡，对此推测尚需进一步证实。
Rosell等[17]从2个PMWS慢性病例中发现，PCV2从猪的鼻、口腔侵入体内，在扁桃体和局部淋巴结增殖后，向其它淋巴组织、肺、肝和肾扩散，受慢性感染的影响，诱发免疫抑制、肠炎、间质性肾炎及肝脏损伤。Hirai等[146]对试验性感染PCV2而发生急性感染的仔猪进行研究发现，仔猪肝脏的病变特征表现为肝小叶中心坏死、肝板破坏、枯否氏细胞增生及肝窦状隙中巨噬细胞增加。肝细胞常肿胀，有时在其核内存在嗜红细胞的细胞核内包涵体。在肝细胞、枯否氏细胞的胞浆中常见小颗粒状的嗜碱性到嗜中性包涵体。在肝细胞、枯否氏细胞及浸润的巨噬细胞中存在大量PCV2抗原和核酸，在肝细胞中，PCV2抗原和核酸主要位于其细胞核内，在核周围也零星存在，而在枯否氏细胞及浸润的巨噬细胞中，PCV2抗原和核酸主要位于细胞浆内，而细胞核中很少。在肝细胞、枯否氏细胞及浸润的巨噬细胞胞核内不存在病毒粒子。肝细胞的细胞核及一些凋亡小体表现TUNEL染色阳性，并且这些TUNEL染色阳性的肝细胞主要位于肝小叶坏死区域及其周围。电镜观察结果显示，胞浆内包涵体主要分散在退化的或无核的坏死肝细胞及巨噬细胞中，并且在包涵体中含有直径约为17 nm的无囊膜的呈晶格状排列的病毒粒子。发生凋亡的肝细胞其染色质固缩，并有核膜包围。因此，作者推测细胞凋亡可能参与了肝脏病变的产生。
Allan等[72]则认为PMWS很可能是PCV2和猪小核糖核酸病毒共同作用的结果。猪小核糖核酸病毒在猪的免疫细胞中复制，所以很可能诱发免疫抑制，促进PCV2的复制。或者猪小核糖核酸病毒活化了作为PCV2靶细胞的单核巨噬细胞类细胞，促进了靶细胞对PCV2的感受性。
从以上研究结果可见，PCV2对机体的影响表现在三个方面：①PCV2本身的致病性；②其它免疫刺激因子对免疫系统的刺激，促进了PCV2的复制而使机体病情加重；③PCV2对机体免疫系统的影响，使机体的免疫抵抗力下降，造成其它病原的继发感染，从而引起更加严重的临床症状。
7 PCV2诊断方法的研究
临床上对于PCV2相关疾病的诊断，常根据疾病的流行特征、临床症状和病理变化作出初步诊断。但要确诊，还要借助于实验室检查的结果。PCV2的实验室诊断方法可分为两类：一类是病毒学方法，一类是血清学方法。
7.1病原学方法
目前常用于PCV诊断的病原学方法主要有病毒的分离与鉴定[15,19,72,147]、原位核酸杂交[148,149,150]、免疫组化[15,126,151]、间接免疫荧光[22]、PCR[152,153]及PCR-RFLP[154]等。
7.1.1病毒的分离与鉴定
感染猪的许多组织，特别是淋巴结和肺脏中均含有PCV病毒粒子，该方法是诊断PCV的常规方法。在进行病毒分离时，可应用经PCR检测确认没有PCV污染的PK-15细胞或没有PCV污染的PK-15细胞进行分离，接种材料使用肺、淋巴结或肺、肝、肾、脾的混合乳剂，并用氯仿处理，以除去有囊膜的病毒。PCV在培养细胞上不表现细胞病变，且增殖滴度低，通常要使用D-氨基葡萄糖处理感染细胞，以提高病毒的增殖量。在接种PS细胞24 h后，1%-2%的细胞出现抗原，6-7 d后感染细胞最高达50%，但病毒滴度只有103.5-104..5 TCID50mL -1 [20]。因此通常在病毒接种后3 d，用免疫组化染色、间接荧光抗体法、原位核酸杂交、PCR或电镜观察，确认病毒的存在[16,17]。
7.1.2原位核酸杂交(ISH)
Allan等[7]以克隆的PCV-PK15的复制型(RF) DNA为探针，可检测出福尔马林固定组织病料中的病毒DNA。该方法灵敏度较高，可以精确定位PCV在组织器官及其细胞中的存在部位，可用于临床病料的检测和病理分析。目前又发展了一种快速ISH方法，该方法使用一种快速杂交缓冲液，不仅可以用于福尔马林固定组织的检测，也可直接用于细胞培养物的检测。这种方法与普通ISH相比可大大缩短检测时间，更适于常规PCV的诊断。在这些方法中，所用核酸探针是来自于PCV1 DNA或PCV2的ORF1序列，由于交叉反应的存在，不能区分PCV1与PCV2，具有群特异性[7,9,15]。Nawagitgul等[150]用PCV2 DNA作探针，建立了一种PCV2特异性检测方法，该方法可用于PCV1与PCV2的鉴别诊断。
7.1.3间接免疫荧光法（IIF）
Allan等[7]将组织病料接种于PK-15细胞并培养一段时间，经丙酮固定后，用兔抗PCV高免血清与细胞培养物中的PCV反应，可对PCV进行检测和定型。试验时可用PCV1或PCV2两种高免血清分别与接种PCV的细胞培养物反应，虽然这两种血清与PCV反应时会出现一些交叉反应现象，但同型抗原与抗体反应时，血清的效价要高于异型反应的效价。IIF适宜于细胞培养物中PCV的检测。
7.1.4 PCR法
从PCV DNA链上设计一对特异性引物进行PCR反应，可直接检测组织病料及细胞培养物中的病毒核酸，是一种快速、简便、特异的方法。Ouardani等[155]建立了一种简单的多重PCR法，可对PCV进行检测和定型。该方法根据PCV的ORF1及ORF2序列设计了2套引物，第1套引物有2对引物组成，其中1对引物扩增ORF2基因上的488 bp片断，可检测PCV1和PCV2，另1对引物只扩增PCV1 ORFl基因上的375 bp片断；第2套引物也含有两对引物，其中1对引物扩增ORFl基因上的646 bp片断，可检测PCV1和PCV2，另1对引物只扩增PCV1 ORF2基因上的425 bp片断。这2套引物都可以对PCV进行检测和定型。Brunborg等[152]又发展了一种定量PCR方法，可对血清/血浆及组织病料中的PCV2进行定量检测。该方法是通过对含有PCV2 ORF2基因的质粒进行一系列稀释来建立一个标准曲线，用于估计病毒DNA在待测组织中的拷贝数。检测结果表明，PMWS感染猪与健康猪中病毒含量差异极显著，在感染猪，每mL血清或500 ng组织样品中PCV2拷贝数高于107，而在健康猪中的含量却不超过106，并且该结果与免疫组化法的符合率很高。此外，Yu等[156]建立了一种反转录PCR(RT PCR)方法来检测复制型病毒。作者设计了2对引物，1对引物是扩增PCV2 ORF2基因的全长DNA(984 bp)，另1对是扩增经切割的ORF2衣壳蛋白的mRNA(594 bp)。结果从病毒培养物的DNA中只能扩增出984 bp片断，不能扩增出594 bp片断，而从提取的PCV2 RNA中只能扩增出594 bp片断，并且最早可在病毒感染后14 h检测到。
7.1.5 PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism)
该方法不仅可对PCV进行检测和定型，而且可对不同来源的PCV进行分类，这对不同地区PCV2的诊断和防治具有重要意义。
7.1.6捕获ELISA法
McNeilly等[157]用PCV2免疫小鼠制备了抗PCV2的单克隆抗体，并用单克隆抗体包被酶标板，建立了可检测PCV2抗原的捕获ELISA方法。
7.2血清学方法
7.2.1间接免疫荧光法(IIF)及免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)
IIF和IPMA是目前诊断PCV2最常用的血清学方法[68,158]。在用于抗体检测时，可将PCV2接种于96孔细胞培养板的PK-15细胞上，培养一定时间后，经丙酮固定，干燥后即可。但要对PCV1和PCV2进行分型，还需要同时检测每份血清与PCVl和PCV2分别反应的抗体效价，通过抗体效价的比较来进行分型[159,160]。对于间接免疫荧光法，由于其所用的抗体是荧光二抗，因此须在荧光显微镜下观察结果，若出现细胞内荧光，则待检血清为PCV2阳性，否则即为阴性。而对于免疫过氧化物酶单层试验，由于其所用二抗为酶标抗体，因此须通过颜色反应来判定结果。然而，这两种方法不仅费时而且由于PCVl和PCV2之间抗原交叉反应性的存在，使得PCV2检测的特异性降低。
7.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)
最初是用PCV1全病毒为抗原建立的ELISA方法[16]，由于PCVI和PCV2之间具有抗原交叉反应性，因此该方法不能区分PCVl型和PCV2型。为了建立PCV2的特异性诊断方法，Sala等[161]及Walker等[73]分别应用PCV2单克隆抗体建立了一种间接竞争ELISA方法，血清学检测结果表明，该方法的灵敏性和特异性都很高，但仍需用PCV2感染细胞为抗原，而PCV2感染细胞后的滴度较低，因此为抗原的获得带来了一定困难。Truong等[55]以人工合成的PCV2 ORF2蛋白的B-133表位为抗原，建立了一种ELISA方法，并用于PCV2感染的血清学检测，结果表明该方法特异性很高，但其灵敏性不太高，因此不适用于血清学检测。Nawagitgul等[56]应用PCV2全病毒及其ORF2蛋白分别建立了两种ELISA检测方法，并与间接免疫荧光法进行了比较，结果其敏感性比IIF略低，究其原因，作者认为可能是二者所识别的抗原表位不同所致，在IIF中所用抗原是固定的细胞，而在ELISA中所用的抗原是可溶性的，这两种类型的抗原存在共同抗原表位及独特型抗原表位，它们可能识别不同的抗体。同样，Blanchard等[57]也用在昆虫细胞中表达的GST ORF2融合蛋白为抗原建立了一种ELISA检测方法，并与IPMA试验进行了比较，结果表明ELISA方法比IPMA更灵敏，同时作者也发现ELISA法所检测抗体的OD值与IPMA抗体滴度之间有一定的相关性。应用表达蛋白为抗原建立ELISA方法，其抗原制备较简单，产量高，灵敏性和特异性都很好，因此更适用于临床检测及大规模血清学调查。
7 PCV2相关疾病的防制
世界各国目前控制本病的经验证明，对共同感染原作适当的主动免疫和被动免疫对于本病有明显的效果；选择性的预防性投药和治疗，对控制细菌性的混合感染或继发感染，同样有效；但是至今对PCV2引起的相关疾病的病原和致病机制尚未完全了解，因此，还不能完全依赖特异性防制措施，只有同时结合良好的饲养管理，才能更好的控制疾病的发生[162,163]。
PCV2的共同感染原很多，如PRRSV、PPV、SIV、猪肺炎支原体及多杀性巴氏杆菌等，不同猪场的疾病谱往往不同，发病猪场首先要确定自身的共同感染原，并应用相应的疫苗对母猪实施合适的免疫，对确保妊娠期胎儿和哺乳仔猪的安全相当重要。与此同时，通过病原检测确定母源抗体消失后的仔猪和育成猪的共同感染原，采用合适的疫苗和药物防治，才能收到应有的效果。在PCV2的防治中，也有许多人尝试过用血清疗法而达到一定的治疗效果。其方法是采集本场育肥猪的血清，注射给断奶仔猪，一般采用腹腔注射。为了安全起见，必须考虑供血者的选择、血清处理、血清贮存及注射方法等，并且只能在本场猪中采集血清。此外，也有通过“感染”物质的主动免疫来防制本病的报道。所谓的“感染”物质，通常是指本场感染猪的粪便、死产胎猪及木乃伊等，通过用这种“感染”物质对母猪，特别是初产母猪在配种前饲喂，能收到较好的效果。若对有一定抗体的母猪在妊娠80天后再作补充饲喂，则可产生高水平的免疫反应，并通过初乳传给仔猪。这种方法不仅对防制本病有效，而且对其它肠道病毒引起的繁殖障碍也有较好的效果。
此外，良好的饲养管理对于本病的防制至关重要。在这方面，主要应注意以下几个问题：首先是对病猪进行隔离饲养，严重感染猪可进行扑杀、焚烧等，以清除传染原。
其次，要减少猪的应激。过早断奶、断奶后更换饲料及断奶后并窝并群都易造成猪的应激，因此建议在有此病存在的猪场，仔猪断奶的日龄可以延迟至28 d或35 d，断奶后要继续饲喂断奶前的饲料至少l0 d，对于断奶后的仔猪应采用小群或小栏原窝原群饲养，小栏间要有实体隔墙，这样可以减少相互间的争斗，并减少窝与窝之间的水平传播。过早或多次的疫苗注射也可引起免疫刺激及猪的免疫应激，从而促使仔猪产生临床症状，因而必须按照猪场或周边的疫病情况合理制定免疫程序，避免过早或多次对仔猪进行免疫。此外，降低饲养密度，注意通风和保暖，为猪群营造舒适的环境对减少疾病的发生亦相当重要。
最后，要强化猪场的生物安全。猪场的生物安全不但要使用于猪场与外界之间，而且还要使用于猪场内部，即猪舍与猪舍之间。在猪场与外界之间，应减少后备母猪的购入数量。英国的一项调查认为，母猪的高更新率可能是造成猪圆环病毒相关疾病的一个危险因子，由于健康状态来源不同的种猪，其免疫力各不相同，造成猪群不稳定的免疫状态，而且大量引入种猪，有可能带入某种疾病，一旦发生某种疫病，可能造成猪圆环病毒相关疾病的加重或爆发。此外，断奶猪舍在进猪前必须严格清洗消毒，同时执行全进全出的饲养制度。在每个猪舍的入口处必须设计消毒池，饲养人员在进入前必须消毒。
8 PCV2相关疾病的疫苗研究
近年来，在PCV2相关疾病的疫苗研究方面，许多学者进行了有益的探索。目前，有关该病的疫苗研究仅限于全病毒灭活疫苗、DNA疫苗[164]、PCV1-PCV2重组疫苗[165]、及Cap蛋白基因工程亚单位疫苗[166]，并取得重要研究进展。疫苗免疫作为防控PCV-2的主要手段，国内外研究者正在着力研究与开发各种PCV-2疫苗在北美及欧洲已有PCV-2灭活疫苗与亚单位疫苗注册上市，这些疫苗对该地区PCV-2的控制发挥了巨大的作用。
对于圆环病毒病疫苗的研制和生产在我国一直处于空白，南京农业大学、江苏南农高科技股份有限公司一直致力于此项研究。然而，试验制作疫苗的过程并不十分顺利，首先遇到的是抗原效价不高的问题，众所周知，猪圆环病毒2型灭活疫苗研发的关键是如何提高抗原效价和提供持续稳定的免疫保护，而PCV-2病毒本身很难在普通细胞内复制，直接培养又常因毒价低难以达到制苗所需的效价。南京农业大学姜平教授自2004年就开展了对PCV-2敏感细胞的克隆研究，经过不懈的努力终于成功地在PK15细胞的基础上克隆出敏感的PK细胞系，同时排除了PCV-1型和肺炎支原体污染。南农高科的“圆克清”为PCV2b，与国内PCV-2流行毒株完全一致，能给国内养猪户提供更好的保护。
